灭活母牛分枝杆菌雾化吸入对哮喘小鼠γδT细胞TLR3的影响*

徐思月，李超乾

（广西医科大学第一附属医院呼吸内科，南宁 530021）

哮喘是一个严重和常见的全球性问题，慢性炎症、反复喘息和气流阻塞是该疾病的标志。目前主要用于治疗哮喘的药仍然是β2 肾上腺素能受体激动剂和糖皮质激素，虽然这种治疗策略在大部分儿童和成人患者中取得了较为满意的疗效，但存在明显的副作用，并且一部分人仍会出现严重的或持续的症状[1]。哮喘的发病机制极其复杂，不能完全用Th1/Th2型细胞因子失衡解释。最近Toll 样受体家族（toll-like receptors，TLRs）是感染及哮喘方面的研究热点，其中TLR3 不仅参与抗病毒反应，而且与哮喘密切相关[2]。本课题组前期研究发现雾化吸入灭活母牛分枝杆菌可以调节哮喘小鼠γδT 淋巴细胞，降低气道反应性和炎症反应[3]，但其具体作用机制，尚未清楚。本实验通过鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA）建立哮喘小鼠模型，用灭活母牛分枝杆菌进行干预，进一步研究母牛分枝杆菌对γδT细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级Balb/c 健康雄性小鼠24 只，6～8 周龄，体重（18～22）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号为SCXK（湘）2019-0014。所有动物严格按照SPF级动物饲养规则喂养。

1.2 主要试剂及仪器

OVA、氢氧化铝（Pierce 公司，美国）；乙酰甲胆碱（Mch，Sigma 公司，美国）；佛波酯、离子霉素（Sigma 公司，美国）；灭活母牛分枝杆菌F.U.22.5 ug 注射液（安徽智飞龙科马生物制药有限公司）；流式抗体PE-TLR3，固定液、破膜液（BD公司，美国），IRF3抗体（abcam 公司，美国），NF-kB 抗体（Abmart 公司）。WH-2000 超声雾化器（上海医疗器械厂），无创型小动物肺功能仪（Fine-PointeTMNAM system；Buxco，Wilmington，NC），FACS CantoⅡ型流式仪（BD公司，美国）等。

1.3 分组与模型建立

将雄性Balb/c小鼠随机分为4组：正常组、哮喘组、低浓度组、高浓度组，每组6 只。第0、第7、第14天，给哮喘组、低浓度组、高浓度组小鼠腹腔注射0.2 mL PBS 混悬液（液体含OVA 40 μg、氢氧化铝1 mg），正常组用等量PBS 进行注射。在第0、第1、第2、第3、第4天时，给予低浓度组小鼠1.125 μg/mL母牛分枝杆菌注射液10 mL 雾化吸入30 min，给予高浓度组2.250 μg/mL 母牛分枝杆菌注射液10 mL雾化吸入30 min，给予正常组和哮喘组等量PBS 雾化30 min。第21、第22、第23、第24、第25 天，将哮喘组、低浓度组、高浓度组小鼠置于自制雾化箱中，给与OVA 溶液10 mL（1 mg OVA/mL PBS）雾化吸入30 min 激发，正常组用等量PBS 雾化30 min。小鼠第25天激发后24 h内进行肺功能检测，检测后麻醉并处死小鼠，留取样本。

1.4 检测指标

1.4.1 气道反应性检测 采用无创型小动物肺功能仪检测小鼠肺功能。将自由活动的清醒小鼠置于体积描计箱，小鼠状态稳定后，正常组、哮喘组、低浓度组、高浓度组均按PBS，6.25 g/L Mch、12.5 g/LMch、25 g/LMch依次进行激发雾化，雾化量为20 μL。小鼠适应5 min，雾化30 s，记录3 min，恢复时间4min。

1.4.2 肺组织病理、糖原染色 腹腔内注射水合氯醛麻醉小鼠，取小鼠左肺小叶，10%甲醛固定，石蜡包埋、切片。将切片脱蜡、梯度酒精水化后分别进行苏木精—伊红（HE）染色和过碘酸雪夫（SPA）染色，然后进行返蓝、透明、脱水、封片，显微镜下观察肺组织病理改变。

1.4.3 免疫组织化学染色检测NF-kB 表达 肺组织切片经常规脱蜡后用柠檬酸进行抗原修复，3%H2O2去除内源性辣根过氧化酶，滴加NF-kB 一抗，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗，滴加增强酶标IgG二抗，室温孵育20 min，PBS 冲洗，DAB 显色，苏木精复染，最后脱水、透明、封片。显微镜下阅片，胞核或胞浆内出现棕黄色为阳性表达，用Image J软件分析。

1.4.4 肺单个核细胞悬液制备 剪碎的肺组织加入胶原酶Ⅳ（2.5 g/L）配置的1640 培养基，37 ℃恒温摇床消化约35 min，用200 目滤网将未消化完全的肺组织和细胞悬液研磨过滤，离心5 min（1 500 r/min），弃上清液后用红细胞裂解液避光孵育，约3 min 后离心5 min，加入PBS 洗涤，洗涤3 次后用1640培养基（含10%胎牛血清）重悬肺单个核细胞。

1.4.5 流式细胞术检测 调整肺单个核细胞悬液浓度，用PBS 洗涤，离心弃上清，加入FITC 抗CD3抗体、Percp抗γδT抗体，避光4 ℃孵育，30 min 后加入PBS 洗涤离心，弃上清后加入破膜液，避光4 ℃孵育20 min 后加入wash-buffer，洗涤离心，加入PE 抗TLR3抗体，避光4 ℃孵育25 min，PBS洗涤2次后丢弃上清液，重悬细胞后24 h 内用流式细胞仪检测，Flowjo X软件分析数据。

1.4.6 蛋白免疫印迹（Western blotting）检测IRF3蛋白表达 将肺组织充分研磨，加入RIPA 裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min 离心10 min；取上清置于EP 管，加入5×SDS 上样缓冲液，煮沸10 min；电泳后将蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h；洗膜，加入IRF3 一抗（1∶1 000）和GAPDH 内参（1∶1 000），4 ℃冰箱过夜孵育；洗膜，加羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），室温下孵育2 h；膜片用扫描仪扫描，条带灰度值用Image J软件分析。

1.5 统计学方法

实验数据均采用SPSS 22.0 软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合方差齐性检验和正态分布用One-way ANOVA 比较组间差异，组间两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灭活母牛分枝杆菌对气道高反应性的影响

在12.5 mg/mL、25 mg/mL Mch 激发后，哮喘组气道反应性比正常组增加（P＜0.01），与哮喘组相比，高浓度组和低浓度组气道反应性降低（P＜0.05或P＜0.01）。在6.25 mg/mL Mch激发后，各组小鼠气道反应性与正常组小鼠相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 灭活母牛分枝杆菌对气道高反应性的影响（n=6）

2.2 灭活母牛分枝杆菌对肺组织病理学的影响

肺组织HE 染色及SPA 染色显示，正常组小鼠支气管形态完好，周围炎细胞浸润少或无，杯状细胞无明显增生和渗出；哮喘组支气管管腔狭窄，管壁增厚，周围浸润大量炎细胞，杯状细胞增生，黏液大量分泌。同哮喘组比较，低浓度组支气管及血管周围浸润炎细胞数量减少，杯状细胞增生减少，无明显黏液分泌；高浓度组支气管及血管周围浸润炎细胞数量减少，杯状细胞增生减少，无明显黏液分泌，且炎症减轻较低浓度组明显，见图2。

图2 小鼠肺组织HE和SPA染色图（×200）

2.3 灭活母牛分枝杆菌对肺组织γδT细胞TLR3表达的影响

与正常组比较，哮喘组TLR3阳性细胞占γδT细胞的比例升高（P＜0.05）；与哮喘组比较，高浓度组TLR3 阳性细胞占γδT 细胞的比例降低（P＜0.05）；见图3。

图3 灭活母牛分枝杆菌对肺组织γδT细胞TLR3表达的影响（n=6）

2.4 灭活母牛分枝杆菌对肺组织IRF3表达的影响

与正常组相比，哮喘组肺组织IRF3蛋白表达量升高（P＜0.05）；与哮喘组相比，高浓度组肺组织IRF3蛋白表达量降低（P＜0.05），见图4。

图4 肺组织IRF3蛋白表达情况（n=6）

2.5 灭活母牛分枝杆菌对肺组织NF-kB表达的影响

与正常组相比，哮喘组NF-kB的表达明显增多（P＜0.01），肺组织呈现大量阳染细胞。与哮喘组相比，低浓度组NF-kB的表达稍减少，高浓度组NF-kB的表达减少（P＜0.05），见图5。

图5 肺组织NF-kB表达情况（×400）

3 讨论

支气管哮喘是以慢性炎症为主，气道高反应性为特征的免疫失衡疾病，与基因和环境及其相互作用有关。哮喘的发病机制十分复杂，其中以Th1/Th2免疫失衡为主，Th17细胞、γδT细胞和相关炎症因子分泌增多等众多免疫反应参与了哮喘的发病及恶化[4]。在本实验中，经OVA建立小鼠哮喘模型，病理切片发现气道炎症细胞浸润增加，杯状细胞增生，黏液大量分泌，气道反应性增高，说明哮喘模型制备成功。

母牛分枝杆菌属于免疫调节剂，可以调节T 细胞增值分化，激活机体固有免疫系统如Toll 样受体，调节特异性细胞免疫反应[5]。T淋巴细胞是体内重要免疫细胞，分为αβT 淋巴细胞和γδT 淋巴细胞。γδT 淋巴细胞主要在气道、皮肤等黏膜组织表达，与气道高反应有关，可以连接适应性免疫和先天性免疫、抵抗病毒感染、调节Th1/Th2 平衡和IgE反应[6-7]。Murdoch 等[8]研究显示γδT 淋巴细胞还可能有助于预防和治疗气道重塑。本实验气道反应性、HE、SPA染色结果发现，母牛分支杆菌干预的两组小鼠气道反应性降低、肺组织炎症浸润减轻，说明母牛分支杆菌可以改善哮喘炎症，这可能与其对γδT细胞的调节有关。

与αβT淋巴细胞相比，TLR3在γδT淋巴细胞上表达更高，在未激活的γδT 淋巴细胞表面，TLR3 极少表达或不表达，当T 细胞受体接受刺激后，TLR3表达增高[9]。病毒感染可以诱发和加重哮喘，TLR3是体内重要的病毒模式识别受体，不仅能识别病毒RNA，而且在没有外源性病毒刺激情况下，小鼠急性缺氧时内源性RNA配体会导致TLR3激活[10]。激活的TLR3 通过MyD88 非依赖通路TRIF 和TRAF3导致IKKε/TBK1 的募集，使IRF3 磷酸化，β 干扰素表达。β 干扰素除抗病毒和抑制肿瘤增殖外，还可以诱导B细胞产生、T细胞活化、中细粒细胞增加和启动NF-kB功能，导致哮喘气道炎症细胞聚集和粘液分泌增加[11]。嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞等大量炎细胞浸润，尤其是作为哮喘特异性标志的嗜酸性粒细胞[12]，可以导致气道上皮受损、组胺释放、成纤维细胞迁移和分化、气道间质细胞合成增加、IL-4和IL-13分泌增多等，最终造成哮喘恶化和气道重塑。在OVA致敏的敲除TLR3基因的哮喘小鼠中，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞显著减少，Th1炎症因子增加，Th2 炎症因子减少，说明TLR3 在哮喘炎症和气道重塑中有重要的潜在作用[13]。此外，TLR3介导IRF3和NF-kB活化可以促进IL-17的产生引起哮喘恶化[14]，我们课题组之前的实验已经证实雾化吸入母牛分枝杆菌可以抑制γδT细胞分泌IL-17，降低哮喘炎症和气道反应性[15]。本实验中，与正常组相比，哮喘组小鼠肺组织细胞混悬液γδT 淋巴细胞上TLR3 表达增加，肺组织IRF3、NF-kB 表达升高。与哮喘组比，高浓度组TLR3、IRF3、NF-kB 下降，说明高浓度灭活母牛分枝杆菌可能通过减少肺部γδT淋巴细胞TLR3 及IRF3、NF-kB 表达来改善哮喘气道高反应性和炎症。

综上所述，灭活母牛分枝杆菌雾化吸入对哮喘小鼠有保护作用，可以改善肺组织炎症，降低气道反应性，其作用机制可能与γδT细胞TLR3的表达及IRF3/NF-kB通路有关。