乌饭树叶黄酮对UHT奶加工过程中晚期糖基化末端产物的抑制作用

薛海波，张洁菡，金思洋，彭英云，杨治风，陈义勇

（1.常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2.江苏梁丰食品集团有限公司，江苏 张家港 215623；3.张家港市畜牧兽医站，江苏 张家港 215699）

晚期糖基化末端产物（advanced glycation end-products，AGEs）是在非酶促条件下，蛋白质中游离的氨基与还原糖的羰基经过缩合、重排、降解、氧化等复杂反应生成的[1].越来越多的证据表明AGEs能够导致许多疾病如糖尿病、阿尔茨海默病、肾功能障碍、心血管疾病等[2-3].研究表明AGEs一方面来源于食品热加工过程，另一方面来源于人体环境，并且可以在人体中长期积累、存在，从而对人体健康造成影响.因此，寻找能够有效抑制AGEs形成的物质显得尤为重要.

UHT奶常温贮存时间长（6个月），方便销售，占据液体奶市场主导地位[4].然而UHT奶加工和贮藏过程中会产生对人体有害的产物AGEs.如何降低UHT奶加工过程中产生AGEs是急需解决的问题.

黄酮作为乌饭树叶中重要的一类具有功能活性的化合物，目前的研究主要集中在其提取[5-7]、分离及结构[8]、生物活性如抗氧化活性[9]、降血糖[10]等方面，但是关于乌饭树叶黄酮抑制晚期糖基化末端产物的研究未见报道.因此本文以UHT奶为研究对象，探究乌饭树叶黄酮对UHT奶加工过程中AGEs的抑制作用，旨在为乌饭树叶黄酮在UHT奶加工和贮藏中的应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乌饭树叶黄酮（本实验室提取纯化）；原料乳（江苏梁丰食品集团有限公司提供）；甲醇、磷酸氢二钠、Nα-乙酰基-L-赖氨酸、硼酸钠、硼酸、硼氢化钠、三氯乙酸（均为分析纯）（上海国药集团化学试剂有限公司）；蔗糖脂肪酸酯、单甘油脂肪酸酯（广州立胜贸易有限公司）.

1.2 仪器与设备

RT-6000酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；AH-BASIC均质机（安拓思纳米技术苏州有限公司）；TG16-WS高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Agilent LC-MS（美国安捷伦公司）；HS-150恒温恒湿培养箱（常州市金坛友联仪器研究所）；超高温瞬时杀菌系统（上海沃迪智能装备股份有限公司）；pH计（瑞士METTLER TOLEDO公司）.

1.3 实验方法

1.3.1 调制乳的制备流程

1.3.2 荧光性AGEs含量的测定

根据文献[11]的方法进行荧光性AGEs含量的测定.将2 mL UHT奶和4 mL甲醇混匀，在-80 ℃条件下保存1 h后离心（13 000 r/min）30 min.取0.3 mL上清液，在λex/λem=340 nm/465 nm波长处测定荧光值.以磷酸盐缓冲溶液作为对照，每组样品重复3次.

1.3.3 羧甲基赖氨酸（CML）含量的测定

CML是一种常被用作食品中AGEs的标志物[12].参考Assar等人[13]方法并做适当的修改进行CML的测定.取100 mL UHT奶和0.5 mol/L的硼酸钠缓冲溶液（pH9.2）混合，最终硼酸钠缓冲溶液浓度为0.2 mol/L.加入1 mol/L的硼氢化钠溶液（用NaOH配制）混合均匀，硼氢化钠溶液最终浓度为0.1 mol/L.混合后的样品在4 ℃条件下还原10 h.还原结束后向反应样品中加入三氯乙酸（60%）使其最终质量分数为20%.静止30 min后沉淀蛋白质，再在4 ℃条件下离心（15 000 r/min，10 min）收集沉淀，并向沉淀中加入盐酸（6 mol/L）1 mL，然后在110 ℃条件下水解24 h.水解完成后用氮气吹干得到干燥的蛋白质水解物.将蛋白水解物和3 mL水充分混合直至全部溶解.根据文献[14]的方法采用PCX固相萃取柱进行除杂，具体步骤如下：依次用3 mL甲醇和3 mL纯净水洗脱PCX固相萃取柱，对其进行预活化.活化完成后，取复溶蛋白水解物样品溶液通过PCX固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3 mL水进行洗脱.用5 mL甲醇对目标化合物进行洗脱，收集洗脱液，用氮气将其吹干.将样品重新溶于3 mL水中，用0.40 μm滤膜过滤，利用高效液相色谱-质谱联用仪测定样品中CML的含量，所有样品均做3次平行试验.

1.3.4 UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对荧光性AGEs形成的影响

原料奶经过检验后过滤、冷却、贮存，加入0.3%的复配稳定剂（蔗糖脂肪酸酯和单甘油脂肪酸酯）和5%的白砂糖，充分混匀后加入质量分数分别为2%，4%，6%，8%和10%的乌饭树叶黄酮.过滤均质后在137 ℃条件下进行UHT杀菌，杀菌时间为4 s.按照1.3.2节的方法测定UHT奶样品中荧光性AGEs的含量.以磷酸盐缓冲溶液代替乌饭树叶黄酮作为对照组，每组样品重复3次.

1.3.5 UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对CML形成的影响

原料奶按照1.3.4节的方法处理后按照1.3.3节的方法测定UHT奶样品中CML含量，每组样品重复3次.

1.3.6 不同贮藏温度条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs形成和CML含量的影响

原料奶按照1.3.4节的方法处理后取出冷却至室温，将UHT奶分别贮藏在25 ℃和37 ℃的培养箱中.15 d后取出样品，按1.3.2节的方法测定样品中的AGEs含量.以磷酸盐缓冲溶液代替乌饭树叶黄酮作为对照组，每组样品重复3次.按照1.3.3节的方法测定样品中CML含量，每组样品重复3次.

1.3.7 不同贮藏时间条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs形成和CML含量的影响

原料奶按照1.3.4节的方法处理后取出冷却至室温.将UHT奶贮藏在25 ℃培养箱中，分别于0，10，15，30，60 d时取样，按1.3.2节的方法测定样品中的AGEs含量.以磷酸盐缓冲溶液代替乌饭树叶黄酮作为对照组，每组样品重复3次.按照1.3.3节的方法测定样品中CML含量，每组样品重复3次.

1.3.8 数据处理

每组数据进行3次平行试验取平均值，以“平均值±标准差”表示.采用Origin8.0软件作图，SPSS20 软件处理数据进行方差分析和显著性分析（P＜0.05表示存在显著性差异）.

2 结果与讨论

2.1 UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对荧光性AGEs形成的影响

UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对荧光性AGEs形成的影响结果见图1.从图1可以看出，与对照组相比，当乌饭树叶黄酮添加量大于2%时，相对荧光值随着添加量的增加而下降，说明乌饭树叶黄酮在UHT奶加工过程中具有明显的抑制AGEs生成的作用（P＜0.05），同时确定合适的乌饭树叶黄酮添加量为8%.杨生辉等人[15]的研究则发现玉米须黄酮具有明显抑制AGEs生成的作用，抑制能力随着浓度的增加而提高.

图1 UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对荧光性AGEs形成的影响

2.2 UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对CML形成的影响

UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对CML形成的影响见图2.从图2可以看出，与对照组相比，随着乌饭树叶黄酮添加量的增加，CML的浓度逐步下降，乌饭树叶黄酮在UHT奶加工过程中具有明显的抑制CML生成的作用（P＜0.05）.孙涛等人[16]则发现竹叶黄酮具有抑制糖基化反应进程，抑制CML生成的作用.原因是竹叶黄酮能够与糖基化反应过程中产生的自由基相结合从而起到抑制糖基化反应进程的作用.

图2 UHT奶加工过程中乌饭树叶黄酮对CML形成的影响

2.3 不同贮藏温度条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs形成和CML含量的影响

不同贮藏温度条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs形成的影响见图3.由图3可以看出，与对照组相比，在同一贮藏温度条件下，UHT奶荧光性AGEs形成量随着乌饭树叶黄酮添加量的增大而下降，差异显著（P＜0.05）；乌饭树叶黄酮添加量大于8%时，随着添加量的增大，UHT奶荧光性AGEs形成量差异不显著（P>0.05）.在同一乌饭树叶黄酮浓度条件下，UHT奶中荧光性AGEs形成量随着贮藏温度的升高而增大；乌饭树叶黄酮浓度低于8%时，差异显著（P＜0.05）.这可能是由于UHT奶在贮藏过程中，温度越高越会促进糖类物质发生羟醛缩合并与脂肪发生氧化，产生更多的1,2-二羰基化合物，进而导致更多AGEs的形成[17].不同贮藏温度条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中CML含量的影响见图4.由图4可以看出，与对照组相比，在不同贮藏温度条件下，乌饭树叶黄酮添加量不大于4%时，UHT奶CML含量随着乌饭树叶黄酮添加量的增大下降不显著（P>0.05）；乌饭树叶黄酮添加量大于4%时，随着添加量的增大，UHT奶中CML含量差异显著（P＜0.05）.在同一乌饭树叶黄酮浓度条件下，UHT奶中CML含量随着贮藏温度的升高而增大.因此低温贮存以及添加8%的乌饭树叶黄酮更有利于降低蛋白糖基化的进程，减少AGEs的形成和CML的含量，提高产品的安全性.

图3 不同贮藏温度条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs形成的影响

图4 不同贮藏温度条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中CML含量的影响

2.4 不同贮藏时间条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs的形成和CML含量的影响

不同贮藏时间条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs形成的影响见图5.由图5可以看出，与对照组相比，在同一贮藏时间条件下，UHT奶中荧光性AGEs的形成量随着乌饭树叶黄酮添加量的增大而下降，差异显著（P＜0.05）；乌饭树叶黄酮添加量大于6%时，随着添加量的增大，UHT奶中荧光性AGEs的形成量差异不显著（P>0.05）.在同一乌饭树叶黄酮浓度条件下，UHT奶中荧光性AGEs的形成量随着贮藏时间的延长而增大；贮藏时间不超过15 d时，差异不显著（P>0.05），贮藏时间超过15 d时，差异显著（P＜0.05）.这可能是由于UHT奶在贮藏过程中，时间越长越会促进糖类物质发生羟醛缩合并与脂肪发生氧化，导致更多AGEs的形成[18].不同贮藏时间条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中CML含量的影响见图6.由图6可以看出，与对照组相比，在不同贮藏时间条件下，随着乌饭树叶黄酮添加量的增大，UHT奶中CML含量逐步下降（P＜0.05）；在同一乌饭树叶黄酮浓度条件下，UHT奶中CML含量随着贮藏时间的延长而增大.因此，UHT奶的贮藏时间不宜超过15 d，低温贮存以及添加乌饭树叶黄酮有利于减少CML的含量.

图5 不同贮藏时间条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中荧光性AGEs形成的影响

图6 不同贮藏时间条件下乌饭树叶黄酮对UHT奶中CML含量的影响

3 结论

本文以UHT奶为研究对象，以乌饭树叶黄酮抑制UHT奶加工和贮藏过程中晚期糖基化末端产物为核心，阐明了乌饭树叶黄酮抑制UHT奶中AGEs和CML产生的效果.结果表明：在UHT奶加工过程中，乌饭树叶黄酮具有明显的抑制AGEs和CML生成的作用，并且随着乌饭树叶黄酮添加量的增大，抑制作用逐步增加.在UHT奶贮藏过程中，低温贮存以及适当增加乌饭树叶黄酮的添加量更有利于降低蛋白糖基化的进程，减少AGEs的形成和CML的含量，提高产品的安全性.乌饭树叶黄酮能够在UHT奶生产和贮藏过程中有效调控有害物质的产生，具有较好的抗糖化作用，在乳制品的生产过程中作为一种天然有效的AGEs抑制剂具有广阔的应用前景，其抑制机理有待进一步深入研究.