黄茶多糖对高脂诱导肥胖小鼠肠道菌群的调节作用

房思维，胡雨萌，王海松

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

0 引言

哺乳动物肠道内寄居着大量的微生物，这些微生物的重量约占粪便干重的1/3[1].数量如此庞大的微生物与机体共同构成了一个稳定的肠道内环境，辅助机体代谢未被胃肠道消化液水解的食物组分，产生诸如短链脂肪酸和维生素等有益健康的物质，为机体提供能量及营养素[2].研究表明，高糖、高脂膳食，抗生素的使用，以及不健康的生活习惯等均可导致肠道菌群紊乱, 而肠道菌群紊乱又与代谢性疾病（如肥胖和糖尿病）、胃肠道疾病、精神系统疾病等相关[3-4].因此建立和维护稳定的肠道微生态对机体健康至关重要.

黄茶的饮用历史悠久，是我国典型的六大茶类之一，属于轻度发酵茶，具有黄叶、黄汤、滋味鲜爽等特点[5].研究表明，黄茶水提物具有缓解高脂诱导的小鼠肥胖、降血脂和降血糖等功效[6-8].而多糖是黄茶水提物的重要组分之一，具有清除自由基，调节机体氧化还原状态等功效[9].非淀粉类的化学结构[10]使得黄茶多糖可以“逃过”胃和小肠内消化酶的水解到达结肠，被结肠微生物发酵.目前，虽然已有大量关于茶多糖健康功效的研究，但是鲜有关于黄茶多糖调节肠道菌群的报道.本研究在前期建立的肠道菌群体外培养模型的基础上，通过16S rRNA测序技术，研究了不同剂量的黄茶多糖对高脂诱导肥胖小鼠肠道菌群的调节作用.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

黄茶购自安徽省霍山县亨大茶叶有限公司；Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒购自上海生工生物股份有限公司；培养基（型号为PDNM001A）购自比利时ProDigest公司； Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒购自上海生工生物股份有限公司.其余试剂均为分析纯，购自国药集团.

台式真空冷冻干燥机（LGJ-10，宁波新芝生物科技有限公司）；漩涡混合器（VORTEx3，上海达姆实业有限公司）；恒温震荡培养箱（THZ-98C，上海一恒科学仪器有限公司）；核酸定量仪（赛默飞世尔科技有限公司）；凝胶成像仪和PCR仪（美国伯乐公司）.

1.2 实验方法

1.2.1 黄茶多糖溶液的制备

黄茶多糖采用水提醇沉法[9]制备：取100 g黄茶，用1 000 mL去离子水95 ℃浸泡30 min，过滤得茶汤，将茶汤浓缩后加4倍体积的无水乙醇，4 ℃静置10 h，分离沉淀弃上清液得粗黄茶多糖.将粗黄茶多糖用去离子水溶解后加入4倍体积的无水乙醇，10 h后分离沉淀弃上清液，重复上述操作5次以去除色素、单糖和小分子物质，得纯化的黄茶多糖.将纯化后的黄茶多糖溶水后旋蒸（45 ℃，60 r/min）除去乙醇，然后真空冷冻干燥得黄茶多糖.称取0.1 g黄茶多糖溶解于20 mL去离子水中，得5 mg/mL黄茶多糖母液，0.22 μm微孔滤膜过滤后备用.

1.2.2 肠道菌群体外发酵黄茶多糖

体外模拟小鼠肠道菌群发酵黄茶多糖的操作流程如图1所示.

图1 实验流程图

1.2.2.1 培养基的配制

称取15 g培养基（PDNM001A）溶于1 000 mL去离子水中（培养基中含有1.2 g 阿拉伯胶，2 g果胶，0.5 g木聚糖，0.4 g葡萄糖，3 g酵母抽提物，1 g蛋白胨，3 g黏蛋白和0.5 g L-半胱氨酸），用浓盐酸调节培养基的pH至2.0.在培养基中加入180 mL胰液（每升胰液中含有碳酸氢钠12.5 g，胆盐6.0 g，胰酶0.9 g），水解2 h后调节培养基pH至6.4.将培养基分装至50 mL西林瓶中，每瓶装培养基16 mL，然后用高纯氮气洗涤培养基30 min.洗涤结束后用胶塞密封西林瓶，并将西林瓶中培养基上层空间的气体置换成高纯氮气，再于121 ℃灭菌15 min备用.

1.2.2.2 肠道菌群收集

分别取饲喂两个月正常日粮（脂肪提供10%能量）和高脂日粮（脂肪提供45%能量）小鼠的结肠内容物4 g，溶解于20 mL磷酸盐缓冲液（0.88 g 磷酸氢二钾，0.68 g磷酸二氢钾，0.1 g巯基乙酸钠溶于100 mL去离子水）中备用.

1.2.2.3 体外模拟肠道菌群发酵

将装有无菌培养基的西林瓶随机分为5组，每组3个平行，分别为：

正常组： 接种4 mL正常日粮饲喂的小鼠肠道菌群溶液；

肥胖组： 接种4 mL高脂日粮饲喂的肥胖小鼠肠道菌群溶液；

肥胖+低剂量黄茶多糖组： 接种4 mL高脂日粮饲喂的肥胖小鼠肠道菌群溶液，并加入200 μL黄茶多糖母液（黄茶多糖终浓度为0.05 mg/mL）；

肥胖+中剂量黄茶多糖组： 接种4 mL高脂日粮饲喂的肥胖小鼠肠道菌群溶液，并加入400 μL黄茶多糖母液（黄茶多糖终浓度为0.10 mg/mL）；

肥胖+高剂量黄茶多糖组： 接种4 mL高脂日粮饲喂的肥胖小鼠肠道菌群溶液，并加入600 μL黄茶多糖母液（黄茶多糖终浓度为0.15 mg/mL）.

将上述5个实验组于37 ℃恒温震荡培养箱中培养24 h，取1 mL发酵液离心，弃上清液，保留沉淀，用于肠道菌群结构分析.

1.2.3 肠道菌群结构分析

肠道菌群结构分析方法参考任鹏飞等人的报道[11].首先，采用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒对1.2.2.3中各组发酵24 h时发酵液中的细菌总DNA进行提取；然后采用分光光度计对DNA的质量进行检测，将OD260/OD280介于1.7～1.9之间的DNA样品用无菌水稀释至1 ng/μL进行PCR扩增.扩增产物用2%（w/v）的琼脂糖凝胶进行回收纯化，再用Thermofisher公司的建库试剂盒进行文库构建.构建好的文库经检测合格后上机测序，并对测序数据进行处理，分析肠道菌群的结构变化.

1.2.4 统计学分析

采用SPSS 22.0对数据进行统计学分析，结果用平均值±标准差表示，两组数据间分析采用t-test 检验；显著性差异表示为*P<0.05.所有数据结果用 GraphPad Prism 6 软件作图.

2 结果与分析

2.1 发酵液中菌群结构在门水平上的分析

不同剂量黄茶多糖对小鼠肠道菌群在门分类水平上的调节如图2所示.小鼠肠道菌体外发酵24 h后，在门水平上的优势菌为厚壁菌（Firmicutes）、拟杆菌（Bacteroidetes）、放线菌（Actinobacteria）和变形菌（Proteobacteria）.与低脂饲喂的正常小鼠肠道菌群体外发酵24 h后相比，高脂日粮诱导的肥胖小鼠肠道菌群体外发酵24 h后，厚壁菌的相对丰度显著增加（P＜0.05），拟杆菌的相对丰度则显著降低（P＜0.05），厚壁菌的相对丰度与拟杆菌的相对丰度比值显著提高（P＜0.05）.不同剂量的黄茶多糖干预24 h后的肥胖小鼠肠道菌群中，厚壁菌的相对丰度均显著下降（P＜0.05），拟杆菌的相对丰度均显著升高（P＜0.05）.高剂量（0.15 mg/mL）黄茶多糖显著增加了拟杆菌的相对丰度（P＜0.05），而中剂量（0.1 mg/mL）黄茶多糖显著降低了放线菌的相对丰度（P＜0.05）.不同剂量的黄茶多糖均显著降低肥胖小鼠肠道中厚壁菌与拟杆菌的丰度比（P＜0.05），其中中剂量（0.1 mg/mL）黄茶多糖的作用效果优于高剂量（0.15 mg/mL）和低剂量（0.05 mg/mL）黄茶多糖效果.

图2 不同剂量的黄茶多糖在门水平上对肥胖小鼠肠道菌群组成的调节

2.2 发酵液中菌群结构在纲水平上的分析

不同剂量的黄茶多糖对小鼠肠道菌群在纲分类水平上的调节如图3所示.由图可知，占主导地位的肠道菌分别为Erysipelotrichia、Bacteroidia、Clostridia和Deltaproteobacteria.与低脂日粮饲喂的小鼠肠道菌群相比，高脂日粮诱导的肥胖小鼠肠道中Erysipelotrichia的相对丰度显著增加（P＜0.05），Bacteroidia的相对丰度显著降低（P＜0.05）.黄茶多糖显著降低肥胖小鼠肠道菌群中Erysipelotrichia的相对丰度（P＜0.05），显著增加Bacteroidia、Clostridia和Deltaproteobacteria的相对丰度（P＜0.05）.对于降低高脂诱导肥胖小鼠肠道菌群中Erysipelotrichia的相对丰度，增加Bacteroidia的相对丰度，中剂量（0.1 mg/mL）黄茶多糖的作用效果优于高剂量（0.15 mg/mL）和低剂量（0.05 mg/mL）组.

图3 肠道菌群在纲水平上的优势菌

2.3 发酵液中菌群结构在目水平上的分析

不同剂量的黄茶多糖对小鼠肠道菌群在目分类水平上的调节如图4所示.在目水平上，Erysipelotrichales、Bacteroidales、Clostridiales、Desulfovibrionales、Verrucomicrobiales和Deferribacterales占主导地位.肥胖小鼠肠道菌群中Erysipelotrichales的相对丰度显著高于正常小鼠（P＜0.05），而Bacteroidales、Verrucomicrobiales和Deferribacterales的相对丰度显著低于正常小鼠（P＜0.05）.黄茶多糖显著降低肥胖小鼠肠道菌群中Erysipelotrichales的相对丰度（P＜0.05），显著增加Bacteroidales和Clostridiales的相对丰度（P＜0.05）.对于降低肠道菌群中Erysipelotrichales的相对丰度，中剂量（0.1 mg/mL）黄茶多糖作用效果优于高剂量（0.15 mg/mL）和低剂量（0.05 mg/mL）的黄茶多糖.另外，低剂量黄茶多糖显著抑制肥胖小鼠肠道菌群中Desulfovibrionales的增殖（P＜0.05），促进Verrucomicrobiales的生长.

图4 肠道菌群在目水平上的优势菌

2.4 发酵液中菌群结构在属水平上的分析

不同剂量的黄茶多糖对小鼠肠道菌群在属分类水平上的调节如图5所示.在属水平上，Faecalibaculum、Desulfovibrio、Akkermansia、Rikenellaceae_RC9、Mucispirillum、Ruminiclostridium_9、Blautia、Bifidobacterium、Ruminiclostridium和Alistipes为优势菌.肥胖小鼠肠道中Faecalibaculum的相对丰度显著高于正常小鼠（P＜0.05），而Akkermansia、Rikenellaceae_RC9和Bifidobacterium的相对丰度则显著低于正常小鼠（P＜0.05）.高（0.15 mg/mL）、中（0.1 mg/mL）、低（0.05 mg/mL）3种剂量的黄茶多糖均显著降低肥胖小鼠肠道中Faecalibaculum的相对丰度（P＜0.05），并显著增加Rikenellaceae_RC9、Ruminiclostridium、Akkermansia和Alistipes的相对丰度（P＜0.05）；高剂量黄茶多糖还显著增加肥胖小鼠肠道中Desulfovibrio和Bifidobacterium的相对丰度（P＜0.05）；而低剂量黄茶多糖则显著降低肥胖小鼠肠道中Desulfovibrio的相对丰度（P＜0.05），显著增加Blautia和Ruminiclostridium_9的相对丰度（P＜0.05）.

图5 肠道菌群在属水平上的优势菌

3 讨论

长期高脂膳食可导致机体肥胖，而肥胖又会诱发心血管疾病、二型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病[12].目前，虽然肥胖的发病机制尚不清楚，但越来越多的研究表明肠道菌群与肥胖的发生密切相关[13].肠道菌群影响宿主的食物消化、能量吸收以及肠上皮细胞的稳态.肠道菌群紊乱可导致宿主能量代谢失衡，诱导机体脂肪堆积和炎症反应的发生[14].食物中的“非消化性”碳水化合物可通过胃和小肠到达远端结肠，被结肠微生物发酵，从而调节结肠菌群结构，发挥健康功效[15].

本文研究发现，黄茶多糖可显著改变肥胖小鼠的肠道菌群结构，表现为降低厚壁菌门（Firmicutes）和增加拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度.厚壁菌通常在长期高脂日粮诱导的肥胖小鼠肠道中有较高的丰度，而拟杆菌的相对丰度则较低[16].研究结果提示黄茶多糖可通过调节肠道菌群来缓解高脂日粮诱导的小鼠肥胖.刘雪姬等人[17]也报道了高脂饮食小鼠表现出了较高的厚壁菌与拟杆菌的相对丰度比，而在健康小鼠中，这个比值则较低.

与低脂日粮饲喂小鼠的肠道菌群相比，长期高脂日粮饲喂小鼠的肠道菌群结构变化显著.黄茶多糖则显著缓解了高脂日粮诱导的小鼠肠道菌群紊乱，主要表现在纲、目以及科分类水平下的属水平上的菌群结构变化.Faecalibaculum与肠道炎症正相关，在高脂诱导的肥胖小鼠肠道内相对丰度增加[18].本研究发现，黄茶多糖的干预可显著降低该菌的相对丰度，表明黄茶多糖可通过抑制Faecalibaculum的增殖而缓解肠道炎症.Ruminiclostridium_9和Ruminiclostridium是重要的丁酸产生菌，而丁酸作为肠道菌群发酵“非消化性碳水化合物”后产生的重要短链脂肪酸，可为肠道上皮细胞提供能量，从而维护肠道黏膜屏障功能[19].黄茶多糖显著增加肥胖小鼠肠道中Ruminiclostridium_9和Ruminiclostridium的相对丰度，这一结果可能有助于促进肠道丁酸的生成.另外，肥胖小鼠肠道中的Akkermansia和Bifidobacterium相对丰度均显著降低，这二者被认为是与肠道健康正相关的益生菌[20-21].研究表明Akkermansia在肥胖个体肠道中的相对丰度下降[22]，这与我们的动物实验研究结果一致.通过体外模拟肠道菌群发酵，发现中等剂量（0.10 mg/mL）的黄茶多糖干预后Akkermansia的相对丰度显著增加，但本研究中并未发现黄茶多糖对Bifidobacterium有较好的促生长作用，表明黄茶多糖并非良好的双歧因子.肥胖小鼠肠道菌群发酵黄茶多糖24 h后发现，肠道中Blautia的相对丰度有所增加，尤其是高剂量的黄茶多糖（0.15 mg/mL）干预后，使得Blautia的增殖显著，而Blautia被认为是短链脂肪酸的产生菌[23].Desulfovibrio是产生内毒素的革兰氏阴性菌[24].低剂量（0.05 mg/mL）的黄茶多糖可显著促进肥胖小鼠肠道内该菌的增殖，而高剂量（0.15 mg/mL）的黄茶多糖则显著抑制该菌的生长.这可能是高剂量的黄茶多糖促进了短链脂肪酸产生菌的增殖，从而抑制了Desulfovibrio的生长.琥珀酸是微生物代谢产生短链脂肪酸的底物，而Alistipes是肠道中琥珀酸的产生菌[25]，黄茶多糖可促进肥胖小鼠肠道中Alistips的增殖，从而为其他短链脂肪酸产生菌提供更多底物.

4 结论

长期的高脂日粮可诱导小鼠肥胖.本文通过体外模拟肠道菌群发酵，研究不同剂量的黄茶多糖对肥胖小鼠肠道菌群的影响，发现黄茶多糖可调节肠道菌群结构，缓解高脂诱导的肥胖小鼠肠道菌群紊乱，抑制厚壁菌的增殖，促进拟杆菌的生长：属水平上促进Akkermansia、Ruminiclostridium、Blautia、Alistipes等肠道有益菌的增殖，抑制Faecalibaculum、Desulfovibrio等肠道有害菌的生长.