PLCG1、KIF2B和KIF4B基因与完全受精失败的相关性分析

李彦奇，赵琼珍，刘金瑞，黄卫东，2*

(1.新疆碳智干细胞库有限公司，图木舒克 844000；2.新疆佳音医院，乌鲁木齐 830000)

体外受精(IVF)技术使女性输卵管损伤、排卵失败或男性因素不育的多数夫妇获得妊娠，但临床上仍然存在部分夫妇在IVF周期中出现完全受精失败(TFF)的情况。TFF是指在一个周期中所有卵母细胞的受精失败。据报道，在正常精子存在的情况下，IVF后TFF的发生率为4%～16%[1]。目前，普遍认为卵母细胞活化失败(OAF)似乎是导致TFF的主要原因[2]。勒布原理指出精子在受精、促进细胞分裂和父系遗传方面具有重要作用[3]，按照勒布的说法，精子的第二个作用是其特异性蛋白和因子触发Ca+2振荡激活卵母细胞，而且精子中心粒引导卵母细胞和精子核形成合子核[4]。这些研究结果表明，精子在卵母细胞活化、受精卵形成方面都具有积极作用。虽然目前关于TFF的研究主要集中在男性因素，但女性因素也不容忽视。排除卵母细胞储备减少的周期，TFF率为1%～5%[5]。卵胞质内异常的纺锤体及微管结构会导致染色质异常模式的发生而影响受精过程[6]。卵母细胞中异常线粒体或三磷酸肌醇(IP3)信号通路导致Ca2+振荡异常，使激酶/磷酸化酶信号通路异常，皮质反应异常，导致受精失败[7]。TFF的遗传原因是未知的，也可能是多种因素造成的，虽然通常归因于精子因素，也极有可能是卵母细胞异常在其中起到关键作用。因此，本研究旨在通过对IVF周期中经历TFF的夫妇进行全外显子测序，鉴定筛选与TFF相关的候选基因，并分析其功能，以期为进一步研究其作用机制奠定基础。

材料与方法

一、研究对象

选取2019年11月至2021年5月就诊于新疆佳音医院的IVF助孕患者，将IVF后出现TFF的夫妇作为实验组，纳入标准：(1)女性年龄≤40岁；(2)染色体核型正常(46，XN)；(3)辅助生殖治疗中，女性获卵数>4个/周期；(4)周期中所有卵母细胞均受精失败；(5)排除ICSI及补救ICSI。对照组选择行IVF后至少生育一个正常孩子的夫妇，纳入标准：同实验组(1)、(2)、(3)；(4)助孕周期中未见异常受精情况。参照WHO第5版人类精液检查与处理实验手册，纳入研究的所有男性精液常规检查结果均正常。

根据纳入标准，实验组共有64对夫妇，对照组共157对夫妇。本研究已通过伦理审查会批准(JKLL-KY20201221-01)，所有研究对象均签署知情同意书。

二、研究方法

1.精液常规检测：患者手淫取精，充分液化后参照WHO第5版人类精液检查与处理实验手册标准，进行精液常规分析。

2.全外显子测序及基因注释：采集实验组64对夫妇和对照组157对夫妇的外周血 5 ml，用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技)提取DNA。使用Illumina Novaseq 6000高通量测序平台进行全外显子组基因测序检测，AdapterRemoval软件对测序结果进行处理，使用bwa软件将数据与人类标准参考序列hg19版本比对，经去除重复读长后，再采用sentieon软件的Haplotyper算法进行SNP检测，最后使用GATK的VariantFiltration进行过滤，生成可用于后续分析的vcf文件。同时对目标区域的覆盖度及测序质量进行评估。将所有的SNP与dbSNP以及千人基因组数据库进行基因注释。

3.变异基因的筛选及验证：使用“overlap”法筛选基因突变，该突变仅存在于实验组中，而对照组中不存在，显著缩小研究范围。随后利用OMIM(https：//www.omim.org/)、The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)、Pubmed(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和GeneCards(http：//www.genecards.org/)等公共数据库，对IVF 中TFF的显著性差异基因位点进行筛选和功能验证。

三、统计学分析

结 果

一、基础资料比较

本研究共纳入实验组64对夫妇，对照组157对夫妇。统计结果显示，两组患者在女性平均年龄、获卵数、男性平均年龄、精子浓度及精子活力的差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 基础资料比较(-±s)

二、两组患者的差异突变基因分布情况

根据不同组别的SNP位点的突变频率的不同，使用chisq.test(data)命令进行卡方检验(chi-square test)，选择P<0.05的位点，在女性和男性群体中分别筛选到812和823个显著性位点，分别位于606和611个基因上。其中，非同义突变最多，终止变异最少，所有变异皆位于常染色体(表2)。

表2 基因变异分布情况

三、两组患者的显著性基因频率统计

采用“overlap”法，分析实验组中含有、但对照组没有的变异位点，同时剔除同义突变。在实验组女性中获得148个显著基因共164个突变位点，在实验组男性中获得120个显著基因共132个突变位点。

经数据库筛选，将磷酯酶Cγ1(PLCG1)、驱动蛋白家族成员2B(KIF2B)和驱动蛋白家族成员4B(KIF4B)基因作为TFF的候选基因。其中基因PLCG1的rs2228246位点突变属于杂合突变，实验组中有4人携带变异，突变率为6.15%(4/64)，实验组和对照组存在显著性差异(P<0.05)；在男性实验组和对照组群体中，基因KIF2B的rs76337756位点和KIF4B的rs10056252位点也属于杂合突变，分别有3人携带，突变率为4.61%(3/64)，且在实验组和对照组中均存在显著差异(P<0.05)(表3)。

表3 显著性基因频率统计(部分)

四、候选基因的功能分析及验证

经GeneCards(http：//www.genecards.org/)和The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)分析工具对PLCG1、KIF2B和KIF4B基因功能进行验证。PLCG1与IP3 的产生有关，IP3可作为第二信使分子激活PKC、引起细胞内Ca+2释放。PLCG1基因在子宫、子宫内膜、宫颈组织中高表达，在管周细胞、内皮细胞中高度表达(图1)。KIF2B基因的突变将导致有丝分裂进展延迟，出现单极或无序纺锤体，以及双核或死细胞数量增加。KIF2B基因在睾丸、精母细胞中高度表达，其他组织及细胞中没有表达(图2)。KIF4B基因在后期纺锤体动力学和胞质分裂、有丝分裂期间染色体分离中起作用；还可能在有丝分裂染色体定位和双极纺锤体稳定中发挥作用。KIF4B基因在睾丸组织、精母细胞中高度表达，其他组织及细胞中表达较低(图3)。

A：细胞表达特异性；B：组织表达特异性(来源https：//www.proteinatlas.org/)

A：细胞表达特异性；B：组织表达特异性(来源：https：//www.proteinatlas.org/)

A：细胞表达特异性；B：组织表达特异性(来源：https：//www.proteinatlas.org/)

讨 论

全外显子组只占整个人类基因组的1%～2%，但其中对人类疾病有影响的基因突变有85%[8]。全外显子组测序可以针对基因组中的蛋白质编码区靶向富集外显子区域测序。本研究中发现了4例在IVF周期中发生PLCG1基因杂合突变的TFF女性患者，在男性群体中发现了3例KIF2B和3例KIF4B基因突变的TFF患者，这三个基因突变均没有在对照组中发现。因此，这3个候选基因突变可能是IVF 中TFF的致病突变位点。

TFF的原因非常复杂[9]。受精过程涉及一系列连续的步骤，从精子和卵母细胞膜的识别和融合开始，随后触发持续的胞质钙(Ca+2) 振荡，这是刺激胚胎发育所必需的，Ca+2振荡数小时的持续是卵母细胞活化的常见信号，并开始复杂的发育过程以形成受精卵[10]。

经过GeneCards数据库的基因功能验证，PLCG1基因位于20号染色体的长臂上，与IP3 的产生有关，而IP3可作为第二信使分子激活PKC、引起细胞内Ca+2释放。PLCG1基因编码蛋白在子宫内膜、子宫、宫颈等女性生殖部位有较高表达。该基因编码蛋白与精子卵母细胞磷脂酶C zeta 1(PLCZ1)同属磷脂酶C(PLC)家族，该家族成员均具有保守性的C2结构域、EF结构域、PH结构域[11]。大量研究表明，PLCZ1通过IP3途径参与卵母细胞激活和原核形成，对受精后卵细胞状态的激活至关重要[12]。有证据表明，PLCZ1在胚胎发育中具有潜在的作用，尤其是在胚胎早期分裂过程中[13]。研究显示，女性生殖道环境对精子运输和受精过程中也具有重要作用[14]。因此，PLCG1基因可能参与女性受精过程中的机制调节，该基因的突变可能导致受精的失败。

KIF2B基因位于17号染色体的长臂上，属于驱动蛋白家族成员，编码微管运动蛋白，其特征在于驱动蛋白结构域位于多肽中间。KIF2B基因促进微管运动，活跃在中心体上，参与双极纺锤体组装、胞质分裂和染色体运动等多个有丝分裂过程中的关键事件。KIF2B基因编码蛋白在睾丸、精母细胞中高度表达，其他组织及细胞中均没有表达。KIF4B基因位于5号染色体的长臂上，也属于驱动蛋白家族成员。该基因参与ATP依赖性微管运动活动、有丝分裂胞质分裂、有丝分裂纺锤体中区组装等，在后期纺锤体动力学和胞质分裂中起着至关重要的作用，而且在有丝分裂染色体定位和双极纺锤体稳定中也发挥作用。KIF4B基因编码蛋白在睾丸组织、精母细胞中高度表达，其他组织及细胞中表达较低。鞭毛是精子的尾巴，是雄性生育和有性繁殖的重要条件，它含有许多由微管蛋白组成的小管。鞭毛必须要以非常精准和协调的方式跳动，才能使精子逐步游动，否则，则导致男性不育。有研究显示，微管蛋白糖基化的酶修饰是让精子保持直线游动的关键[15]。中心体参与胞内细胞骨架的形成、有丝分裂纺锤体的形成等许多功能。在一些畸形精子患者中，精子中心体功能表现出受损的情况使得受精产生障碍[16]。精子中心体对于鞭毛的发生起着至关重要的作用。在鞭毛的形成中，中心体迁移到细胞外围，以中心粒为基体启动轴丝的组装[17]，中心粒功能障碍也会导致精子尾部鞭毛的缺失[18]。目前关于KIF2B基因的研究发现，其与脑蛋白疏松症[19]、肺腺瘤[20]有关；KIF4B基因与肝细胞癌[21]、胰腺癌[22]等疾病有关，在人类受精的研究中都未见报道。基于以上分析，推测KIF2B和KIF4B基因可能参与精子鞭毛的形成及运动，但其具体功能还需进一步研究。

本研究全外显子测序技术筛选到与TFF相关的PLCG1、KIF2B和KIF4B这3个基因，通过生物信息方法初步分析了基因功能，但这3个基因在TFF发生过程中的确切作用及其机制还需进一步探索。