Z-基因组的生物合成奥秘被揭示

金交羽，周佳海

（中国科学院深圳理工大学，深圳合成生物学创新研究院，中国科学院定量工程生物学重点实验室，广东 深圳 518055）

DNA 由4 种不同的脱氧单磷酸核苷（dNMPs）构成，dNMPs 的区别在于分子结构中碱基的不同。这4 种碱基分别为：胞嘧啶（Cytosine，C）、胸腺嘧啶（Thymine，T）、腺嘌呤（Adenine，A）和鸟嘌呤（Guanine，G）。DNA的碱基上可以被添加各种化学基团，其中包括甲基、羟基、氨基酸、多胺、单糖和双糖等［1］。目前报道的碱基修饰已经超过了50 种［2］。在真核生物中，DNA 的碱基修饰可以在不改变基因型的情况下影响基因的表达表型，部分碱基被修饰过的DNA 可以通过与蛋白质间的形成相互作用使DNA 免于被降解，并参与基因的调控［3］。比如研究得比较充分的胞嘧啶甲基化，甲基转移酶基因能够与限制性内切酶基因形成配对，在破坏外源DNA 的同时可保护自身的DNA 免受限制性内切酶的切割［4］。尽管DNA 的碱基修饰种类繁多，但大多数遵循经典的Watson-Crick碱基互补配对原则［4-5］。

1977 年，Ivan Khudyakov 等［6］从噬菌体（cyanophage）S-2L 的基因组分离和鉴定出一种特殊的碱基--2，6-二氨基嘌呤（Z）。与典型的腺嘌呤碱基（A）相比，Z 碱基在嘌呤分子的2号碳原子上多出一个氨基基团。在经典的Watson-Crick碱基互补配对原则中，A 和T形成2根氢键［图1（a）］，G和C形成3 根氢键［7］。研究发现，S-2L 的基因组中的Z完全取代了A，并与T 互补配对形成3 根氢键，Z碱基额外的氨基可与T形成第三根氢键［图1（b）］，从而增加DNA 双螺旋结构的热稳定性［8］。此后，多家研究单位，包括法国巴斯德研究所，都向Ivan Khudyakov 索要噬菌体S-2L 及其宿主。2002年，法国巴斯德研究所的研究者将噬菌体S-2L 进行测序，并把它的序列及潜在的应用申请了专利（WO2003093461）。他们在专利中推测，噬菌体基因组中腺苷琥珀酸合成酶（PurA）的同源蛋白可能参与Z碱基的生物合成。但多年来，此蛋白的功能一直没有被阐释清楚，且dZTP 是如何被选择性地整合到噬菌体S-2L 的DNA 上等生物学问题也没有得到更深入研究。

图1 胸腺嘧啶与腺嘌呤、二氨基嘌呤形成的氢键作用Fig.1 Thymine forms hydrogen bonds with adenine and diaminopurine

2021 年4 月30 日，上海科技大学赵素文助理教授、天津大学张雁教授和伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校/新加坡科技研究局赵惠民教授合作在Science上发表了题为“A widespread pathway for substitution of adenine by diaminopurine in phage genomes”的论文，报道了参与Z 碱基生物合成的多酶系统，阐明了以dGTP 为起点，一步步转化为可被DNA聚合酶利用的dZTP的完整路径，并提出噬菌体的Z-基因组能够帮助逃避宿主限制性内切酶攻击的基础［9］。

由于NCBI数据库中并无噬菌体S-2L的基因组注释，合作团队首先对噬菌体S-2L 的基因组进行了注释，顺利发现了此前专利中所提到的PurA 同源蛋白，并将该酶命名为PurZ。接下来以EcPurA为模板，构建CpPurZ的结构模型，并与EcPurA的活性口袋进行比对，发现EcPurA 中的催化残基Asp13 在CpPurZ 中对应的是Ser15，这个残基正好对着嘌呤的2 号碳，因此他们推测Asp 到Ser 的突变正好可以容纳比腺嘌呤更大的片段。这一推测被接下来的分子对接所验证，分子对接的结果表明，CpPurZ 及其在其他噬菌体中的同源蛋白（ApPurZ、SbPurZ、VpPurZ 和SpPurZ）的底物可能是dGMP/GMP 和ATP。他们利用质谱实验对几种PurZs 酶活性反应的中间体和产物进行定性和定量的检测，最终发现4 种PurZs 在镁离子存在时，以dGMP、ATP 和L-天冬氨酸为底物生成2-氨基脱氧单磷酸腺苷琥珀酸（ADAS）。由于这些噬菌体中并不存在嘌呤从头合成通路中的腺苷琥珀酸裂解酶（PurB），因此他们推测宿主菌中的PurB应该具有一定的泛杂性，可以将ADAS裂解为dZMP和延胡索酸。随后他们使用大肠杆菌的EcPurB 进行了假设验证，发现它的确可以将ADAS 裂解为dZMP和延胡索酸（图2）。

图2 dZMP的生物合成通路Fig.2 Biosynthetic pathway for dZMP

合作团队通过构建PurZ 编码基因的基因组邻近区相似性网络，发现PurZ 编码基因周围存在2个功能相关基因。其中一个基因编码的蛋白属于金属依赖的磷酸水解酶HD 家族。该蛋白的功能随后被证实为dATP 磷酸水解酶（因此被命名为dATPase），它可在钴离子的存在下，将dATP/dADP/dAMP 水解为磷酸和2'-脱氧腺苷（dA）。dATPase 的生物学功能是不可逆地降低宿主菌中的dATP 的浓度。而另一个基因编码了属于DUF550家族的蛋白。经实验证明，DUF550 为脱氧嘌呤核苷三磷酸的焦磷酸水解酶，可在钴离子的存在下，将dATP/dGTP 水解为dAMP/dGMP 和焦磷酸。因此，DUF550 一方面可以降低宿主细胞中的dATP浓度，另一方面可以为PurZ 提供反应底物dGMP。综合来看，dATPase 和DUF550 都发挥了降低宿主菌中dATP浓度的作用，这使得噬菌体的DNA聚合酶更容易优先选择热力学上更稳定的dZTP，来进行噬菌体DNA的合成。

同时，他们还发现细菌中的GMP 激酶能够将dZMP 磷酸化生成dZDP 及dZTP，dZTP 从而可能被噬菌体的DNA 聚合酶利用，与dTTP、dGTP 及dCTP一起参与Z-基因组的合成（图3）。

图3 推测的Z-基因组生物合成通路Fig.3 Proposed biosynthetic pathway for Z-genome in phage

合作团队通过酶解法水解含有Z-基因组的Acinetobacterphage SH-Ab 15497（由上海交通大学医学院的何平教授提供）DNA，并使用HPLCMS 检测水解产物发现，噬菌体DNA 中的确存在2'-脱氧2-氨基腺苷（dZ），MS/MS结果也可以观察到Z 碱基的存在。同样的水解产物用HPLC-UV 检测发现，dZ/dT和dC/dG的比值分别为0.99和1.05。他们使用纳米孔测序法对含有Z-基因组的Acinetobacterphage SH-Ab 15497 进行测序，结果显示dZTP 被整合到噬菌体的DNA 上。 对Acinetobacterphage SH-Ab 15497 的DNA 进行 的 限制性内切酶实验表明，识别序列中含有A 的限制性内切酶EcoRI、PstI和Sau3AI 并不能切开噬菌体的DNA，其中Sau3AI在该噬菌体的DNA上含有超过200 个识别位点［10］。这些结果表明，Z 完全取代了A，并且Z-基因组赋予噬菌体能够躲避宿主限制性内切酶攻击的优势。

Z-基因组生物合成通路的解析，为科学家研究DNA 的修饰、结构、组装与调控等打开了一扇新的大门。多个含Z-基因组的活性生物体发现，使通过生物方法制备含Z 碱基的新型核酸产品得以实现，也将促进含Z 碱基的DNA 纳米技术开发。在用核酸构建人工设计的结构中，一旦A碱基被Z 碱基所替代，将会在对应的碱基配对处增加一对氢键的键能，这对于核酸链的稳定性和结构产生明显的影响，许多新的DNA 折纸结构将被设计出来。在基于DNA 的数据存档研究中［11］，当Z 碱基被用于替代A 碱基后，能够躲避宿主限制性内切酶攻击，提高了储存数据在活体细胞中的稳定性，而数据的读取可以通过纳米孔测序技术获得且质量不受影响。另外，这项工作也有望应用到合成生物学领域，如通过将Z-基因组生物合成酶结合到工程噬菌体中，特别是已成功应用于多耐药细菌的临床治疗并挽救了患者生命的那些噬菌体中［12-13］，或许可以扩大这些噬菌体的宿主范围。

Science上同期报道了两项来自法国的Z-基因组相关研究工作，其中一篇文章的主要发现与赵素文等的结果类似，但是用了较多的篇幅在描述PurZ 蛋白及其系列复合物的晶体结构信息［14］；另一篇文章则侧重于DNA 聚合酶DpoZ 的发现和鉴定，研究结果表明在复制阶段该酶催化dZTP 加到链上的活性比dATP 强［15］。Z-基因组生物中所发现的DNA 聚合酶能够容忍非经典碱基对的能力是非常值得关注的，在Watson-Crick经典碱基配对原则得到扩充的同时保持DNA 复制的高保真度，这对维持生命有机体遗传信息的完整性具有非常重要的意义。值得一提的是，2021 年4 月23 日Nature Communications发表的一篇文章报道了dATP 磷酸水解酶DatZ 的系列晶体结构和一个疑似聚合酶PrimPol 的晶体结构［16］，不过PrimPol 对催化dZTP与dATP 加到链上的活性没有区分度，这一点与前面提到的DpoZ不同。