基于CRISPR/Cas工具的肿瘤基因线路构建及应用

宋斐，刘宇辰，蔡志明，黄卫人

（1深圳大学第一附属医院，深圳市第二人民医院，泌尿外科，广东 深圳 518035；2广东省泌尿生殖肿瘤系统生物学与合成生物学重点实验室，广东 深圳 518035）

癌症的发生和发展是多因素协同的结果，涉及复杂的信息网络与许多信号分子的相互作用［1］。随着对人类基因组研究的不断深入，发现基因表达调控并非孤立、单一事件，而是存在相互制约和影响［2］。因此，细胞信号通路的调控和干预通常复杂而困难，涉及动态感知和多层次调控。近年来，基于多组学研究对肿瘤发展机制的解析以及肿瘤微环境的认识，在针对性治疗药物的开发及其临床应用上取得了巨大进展。如，靶向PD1/PDL1免疫检查点药物和CAR-T 细胞免疫治疗技术（2018 年获FDA 批准），靶向肿瘤新生抗原的T 细胞回输等，为恶性肿瘤的治疗提供了全新策略。然而，现有治疗策略通常靶点单一，若要进一步提升治疗效果，解决现有药物总体响应率不佳和耐药等问题，需开发出系统性干预的全新技术手段和策略，突破现有治疗瓶颈。

基因线路是指经过人工设计的、由不同功能的生物分子和基因元件组成的集合，它可使单个细胞根据预设的逻辑执行相应功能，在导入活细胞后，感受、整合、处理分子信号，行使特定生物功能。合成生物学利用工程化原理，设计人工基因线路感知细胞内外多重信号，进而做出逻辑判断并通过调控细胞信号网络或释放治疗性药物，系统性影响细胞行为以实现疾病治疗之目的，是有望解决现有治疗瓶颈的有力工具。迄今，合成生物学在医学领域的发展已崭露头角，例如，Lim 等［3］计了双受体AND-gate T 细胞，用以特异高效地清除肿瘤细胞；Lu等［4］构建了基于RNA的免疫调节基因线路，实现免疫刺激剂在肿瘤细胞中表达与释放，激活T 细胞介导的肿瘤杀伤；Fussenegger 等［5］开发出“胰岛素”基因线路，可自动感应小鼠血液胰岛素浓度变化，维持血糖稳定，缓减胰岛素抵抗的症状。

1 基于CRISPR的基因线路识别与干预

十余年来，合成生物学和生物信息学飞速发展，合理设计具有预期功能的高效人工基因线路取得了长足进展［13］。人工基因线路首先在原核细胞中构建，并逐渐在真核细胞中实现［14-16］。目前，生命体和细胞中的信号网络可被重编程，以改变原有致癌信号通路［17］。CRISPR/Cas9 技术为基因线路设计提供了一个高效的工具，极大提高了基因线路的设计和元件效率。已有研究者尝试使用CRISPR 技术构建简单的基因线路用于肿瘤的基因治疗［18-19］。实际上，利用CRISPR 技术构建的基因线路不仅限于肿瘤细胞，还广泛应用于植物［20-21］和动物［4］。然而，人工基因线路应用于人体的安全性一直存在争议，如何利用遗传基因元件构建安全有效的基因线路一直是科学家们面临的难题。

为了解决这个问题，研究者在基因线路设计中引入了人工开关以提高其安全性。目前，已开发出了可由光［22-24］、内源性蛋白质［25］、小分子多西环素［26-27］、阿魏酸钠［28］等外源 信 号控制的CRISPR 开关，控制细胞内信号通路的开放与关闭（图1）。人工、可切换系统的使用提高了基因治疗的安全性，而可感知内部信号蛋白的装置将成为下一代基因治疗工具。

图1 基于CRISPR/Cas技术的人工基因线路［29］（a）在CRISPR/Cas9 基因序列上游插入编码转录因子结合位点的人工序列，通过感知细胞内信号蛋白来控制基因表达。在恶性肿瘤细胞中，一些特定的转录因子被异常激活，如β-catenin 和NF-κB。当癌细胞中的异常信号蛋白与转录因子结合位点结合并且RNA 聚合酶（RNA poly）被募集到TATA-box 时，下游CRISPR/Cas9 基因的表达就会开启。图中Effector 指CRISPR 系统的Cas9 蛋白。（b）癌细胞中基于CRISPR/Cas9技术的光诱导基因表达装置。蓝光刺激诱导拟南芥隐花色素2（CRY2）与其结合蛋白（隐色素相互作用的基本螺旋-环-螺旋蛋白1，CIBN）之间形成异二聚化。因此，与CRY2蛋白融合的转录激活域（AD）被携带到指定区域，促进下游基因的表达。（c）光诱导CRISPR/dCas9的流程。dCas9被分成两个缺乏核酸酶活性的片段，dCas9片段与光诱导二聚化结构域（pMag 和nMag）融合。蓝光刺激诱导pMag 和nMag 之间的异源二聚化，使分裂的dCas9 片段能够重新结合，从而重建RNA 引导的转录激活活性。（d）小分子人工开关系统。多西环素与逆四环素转录激活因子（rtTA）的结合导致rtTA 构象的变化，活化后的rtTA 与Tet反应元件（TRE）进一步结合从而启动靶基因的表达（如Cas9）Fig.1 Schematic representation for the artificial gene circuits developed based on CRISPR/Cas technology(a) artificial sequences of transcription factor binding site are inserted into the upstream of the Cas9 coding sequences to control gene expression by sensing intracellular signal proteins.In malignant tumor cells, some specific transcription factors such as β-catenin and NF-κB are abnormally activated.The expression of the downstream CRISPR/Cas genes is turned on when abnormal signal proteins in malignant cells bind to the transcription factor binding site and RNA polymerase (RNA poly) is recruited to the TATA box.Effector represents the Cas9 protein.(b) the light-inducible gene expression regulation system in cancer cells developed based on CRISPR/Cas9 technology.Blue light stimulation induces heterodimerization between A.thaliana cryptochrome 2(CRY2)and its binding partner CIBN(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix protein 1).Therefore,the transcriptional activation domain (AD) fused with the CRY2 protein is targeted to the specific region and promotes the expression of downstream genes.(c) schematic diagram for the light inducible CRISPR/dCas9 system.The dCas9 is split into two fragments lacking nuclease activity, and the dCas9 fragments are fused with light-inducible dimerization domains (pMag and nMag).Blue light stimulation induces heterodimerization between pMag and nMag, which enables split dCas9 fragments to reassociate, thereby reconstituting RNA-guided transcriptional activation activity.(d) schematic diagram for a small molecular artificial switch system.The binding of doxycycline results in the conformational change of reverse tetracycline transcriptional activator rtTA, and then the activated rtTA could bind to the Tet-responsive element (TRE) to drive the expression of the target genes,such as Cas9 gene.

光调控系统不断更新迭代。Ye 等将红细菌中响应远红光的蛋白BphS，链球菌中的转录因子BldD［30］以及酿脓链球菌中的Cas9核酸酶经理性设计、组装和重编程构成了远红光调控的分割型split-Cas9 基因编辑系统（far-red light-activated split-Cas9 system，FAST），该系统以较低强度的远红光外部照射作为控制手段，借助于远红光本身的组织通透性优势，克服了目前化学小分子调控以及蓝光调控CRISPR/Cas9系统的缺点，具有远程无痕、低本底泄漏、低脱靶效应、低毒性等体内应用优势，能够在时间和空间上特异性地精准控制体内深层组织和器官的基因编辑［31］。Tang等［32］开发一类新型光敏感crRNA，丰富了光诱导型gRNA（guide RNA）的种类。使用维生素E或胆固醇等具有大位阻疏水基团，利用光敏基团将其修饰在crRNA的5′末端得到的光敏crRNA可以正常和Cas9结合形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合物，维生素E 或胆固醇的修饰阻碍了RNP 复合物与目标DNA 三元复合物的形成。在给予光照刺激后，维生素E从crRNA上解离，CRISPR/Cas9恢复功能。Ha 等［33］设计了光敏感、可裂解的gRNA（pcRNA），能够利用光照降解gRNA分子，从而实现对Cas9核酸酶基因编辑活性的调控。

Budeck 等［34］设计了一个光遗传anti-CRISPR系统，由一个化脓性链球菌Cas9（Streptococcus pyogenesCas9，SpCas9）抑制剂AcrIIA4 蛋白和一个来自于燕麦的LOV2光传感器蛋白杂合构成，两者与CRISPR/Cas9 效应器共同表达，从而实现光介导的基因组和表观基因组编辑。

2 CRISPR/dCas9介导的信号传感器

近年来，研究者已经开发出一些人工合成元件来调节细胞基因信号网络。Nissim 等［35］构建了一个双启动子整合器来区分结肠癌细胞和正常成纤维细胞。Xie等［36-38］通过检测5种内源性miRNA分子的差异表达，成功开发了一种特异性细胞分类器，可有效区分HeLa 细胞与其他类型的细胞。Morsut等［39］根据肿瘤相关抗原-受体系统，构建了双受体“与门”T细胞，运用布尔逻辑提高特异性识别肿瘤细胞的能力：在T细胞表面设计合成了两个Notch 受体（即“双受体”），使T 细胞能够识别对应的两种肿瘤特异性抗原，只有当肿瘤细胞同时表达这两种抗原时，该工程化T细胞才能被激活。在肿瘤细胞生长过程中，除miRNA 和细胞表面受体蛋白或抗原性蛋白外，一些内源性蛋白也会直接参与细胞内信号网络调控，发现并利用癌发生发展中的关键信号调控蛋白质，也可开发出更直接的调节元件。

构建复杂基因线路的瓶颈之一是缺乏工程化的基因调控元件，CRISPR 技术则提供了一种有效解决方案，可以极大提升基因线路的设计。Liu 等［40-41］开发了CRISPR 介导的信号传感器，可同时识别多个蛋白质信号，解决了传统基因线路缺陷。该研究创造性地将RNA 核糖开关序列整合到sgRNA 的3′端，构建了一种可控制sgRNA 的新型核糖开关。具体来说，首先构建RNA 核糖开关（riboswitch）序列，该序列包括可感应特定蛋白质信号分子的RNA 核酸适配体（aptamer）以及与DNA 识别区互补的反义RNA。随后将核糖开关序列整合到sgRNA 的3′端，在没有相应信号存在情况下，反义RNA 保持双链，不对靶基因转录产生调控作用，当目标信号与核酸适配体结合后，分子构象发生变化，双链反义RNA 打开形成单链，使得DNA 识别区域能够与靶基因启动子区结合从而产生转录激活或抑制效果。该基因线路在活细胞水平特异感应多个肿瘤信号分子（ETS-1、AFP、NF-κB、β-catenin），进而激活多条下游抑癌信号通路（E-cadherin 细胞迁移通路、Bax-Bcl2细胞凋亡通路），由此组成新的“信号转导网络”，“重新编程”癌细胞的分子信息程序，逆转其恶性生物学行为，或诱导其凋亡（图2）。受蛋白质信号调控的CRISPR/dCas9 转录因子能动态响应，并有效处理不同的肿瘤信号，进一步改变细胞内信号传递（信息流）方向，这种特性使其有潜力发展成为构建人工基因线路的重要工具。因此，这种新型CRISPR/dCas9 介导的信号传感器可在合成生物学和癌症治疗中得以发挥更多应用。

图2 基于CRISPR/Cas 技术的信号传感器［β-catenin激活Wnt通路，促进肿瘤细胞增殖。人工设计的sgRNA优先结合内源性β-连环蛋白，进而被激活。接着，人工设计的sgRNA与dCas9蛋白结合，并与靶序列结合、激活输出基因，如内源性抑癌基因（如p53）或凋亡基因（如p21和caspase 3），使肿瘤细胞由癌发生信号通路重新定向为抗癌信号通路］Fig.2 Schematic diagram for the signal conductor that links one signal with another developed based on CRISPR/Cas technology[The β-catenin activates the Wnt pathway,and promotes the proliferation of tumor cells.The redesigned sgRNA preferentially binds to the endogenous β-catenin,and then couples with dCas9-AD protein to activate the output genes,such as the endogenous tumor suppressor genes(eg,p53)or apoptosis genes(eg,p21 and caspase 3),enabling the tumor cells to redirect oncogenic signaling to an anti-oncogenic pathway.]

3 基于CRISPR/Cas9 技术的多基因同步调控

与传统的基因编辑工具如转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）和锌指核酸酶（ZFNs）相比，CRISPR/Cas9不仅高效便捷，尤其具有在单个细胞内同时调控多个靶点的潜力［42］。将dCas9 蛋白融合到某基因的转录抑制或转录激活结构域，便可下调或上调特定的单个基因，随着CRISPR 技术的成熟，利用多基因靶向串联sgRNA 阵列设计即可实现同时调控多个内源基因的表达［43］，并且这种控制可以按需求而人为设置。

单是酒单维护就已经足够挑战，“维护一个好酒单非常难，要花很多心思，侍酒师有权去加酒或者减酒，但是哪些酒可以加，哪些酒不可以加，哪些年份不想要等，都需要花很多时间精力去衡量”。

当dCas9直接与一个转录相关域（即激活或抑制）融合时，它仅提供一种调节方法。然而，有研究已经表明sgRNA 可以招募不同的转录相关结构域，因而具有同时上调和下调不同基因的能力［44］。RNA 结合蛋白用于携带相应的转录相关结构域，并特异性结合RNA 发夹结构，不同的RNA发夹结构与sgRNA 融合后，可以激活或抑制相应基因的转录。这一技术为癌症的精准治疗提供了广阔的应用前景和巨大的应用价值，也为生物医学科学提供了更多的可能性。然而，基因在肿瘤细胞的生长发育中始终发挥着重要作用，但基因的功能复杂多变，因此需要针对不同的基因选择不同的调控方式。

4 基于新型CRISPR/dCas12a 的工程细胞信号传导

CRISPR/Cas9 系统在肿瘤精准治疗中潜力巨大，其有效递送至靶细胞是一个影响应用的重要因素。SpCas9是最常用的CRISPR核酸酶基因，大小约为4.2 kb，这是现有生物技术应用中常见的分子大小。然而，在细胞中表达Cas9 蛋白还需要增加启动子等调控元件，这就增大了该基因系统的总体大小。此外，若要细胞中表达的Cas9/dCas9蛋白不发挥其生物学功能，还需要在细胞中共表达其他成分（如sgRNA、供体模板、转录激活子或转录阻遏物等），共表达载体的尺寸通常大于现有病毒载体容量，因而难以使用常见的载体（如腺相关病毒AAV）递送这一“庞大”基因系统。

目前的解决方案是使用小型化、拆分的SpCas9蛋白和CRISPR系统。研究者们相继发现了一系列尺寸较小的CRISPR/Cas 蛋白，如来自金黄色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）［45］（3.2 kb）、新发现的基因组编辑工具CasX（3.0 kb）［46］，或构建mini-SpCas9 等系统［47-49］。然而，小型化CRISPR 基因编辑效率可能远低于野生型SpCas9 以及来自普雷沃菌（Prevotella）和弗朗西斯菌1（Francisella1）的CRISPR（Cpf1，也称为Cas12a）。Cas12a 是麻省理工学院张锋研究组发现的一种比Cas9 更小的蛋白质，易于包装和递送，其在哺乳动物细胞中具有与SpCas9 相当的靶向切割效率。通过对Cas12a 基因两个位点（D10A、H841A）进行点突变，可使Cas12a 蛋白丧失核酸内切酶的活性（dCas12a），但保留其通过sgRNA 结合特定DNA序列的能力，其在基因组编辑中的信号放大和转录调控方面具极大的应用价值。

Cas12a 对靶标识别更加严格，其有望解决Cas9“基因靶向特异性低”的问题。Liu 等［50］首先在真核细胞鉴定了CRISPR/dCas12a 调控基因转录激活或抑制的能力，再利用构建crRNA 偶联核糖开关、将G 蛋白偶联受体融合到Cas12a 蛋白这两种方式，分别实现了细胞内不同类型配体分子控制的可编辑Cas12a 系统以调节内源基因转录。这一设计使细胞能够通过响应不同类型的配体信号调节内源性基因的转录，从而在细胞内构建具有全新输入-输出连接的人工信号通路，以控制细胞行为。当从一个转录本中加工多个串联的crRNA 时，该系统表现出信号放大，这符合细胞内信号传递级联放大的重要特征，提示Cas12a 为工程化定制细胞信号线路提供了一个可靠、有效的平台，极大提高了智能化基因线路在未来精准癌症治疗中的应用潜力。

5 无启动子基因表达技术（CRISPReader）

随着CRISPR 系统结合并激活靶DNA 转录能力的不断优化，基于CRISPR 的人工基因表达调控装置得到了广泛的研究［51］。基因由DNA 密码子组成，包括启动子及其读码控制等表达元件。Liu等［52］利 用CRISPR 开 发 了 一 种 读 码 系 统（CRISPReader），它是一种新型的以稳健方式控制的非启动子依赖的基因表达技术，其显著特征是能够“阅读”基因簇的开放阅读框架，而不需要传统的调控元件或其他辅助因子。该系统通过TATA 盒进行初步转录起始，然后利用sgRNA 介导的基于dCas9 的转录激活因子与TATA 盒上游序列的结合促进转录，实现正反馈的表达回路（图3）。利用该策略建的紧凑型AAV-CRISPR-Cas9 一体化系统，简化了冗余的基因线路，消除调控元件与细胞基因组之间的相互干扰，不仅在反式激活、DNA 切割和基因编辑方面比编码两个独立Cas9 元件的双AAV 载体更有效，还解决了现有AAV 对CRISPR系统包装尺寸问题。

图3 CRISPReader 通过耦合转录和翻译机制来驱动无启动子基因表达［52］（a） CRISPReader 通过组合的转录和翻译的平台构成。当dCas9-VP64 融合蛋白包括1 个催化失活的Cas9 和1 个VP64 转录激活结构域，VP64 结构域可招募RNA 聚合酶Ⅱ，sgRNA 与靶基因TATA 盒上游位点同源，sgRNA 与靶序列结合进一步引导dCas9-VP64 结合与TATA 盒上游，强力激活靶报告基因RLuc的转录。RNA激活导致转录起始因子复合物的形成，其包括eIF4G以及招募来的核糖体，这时翻译启动。（b） CRISPReader 驱动基因簇表达的机制。在dCas9-VP64 激活转录后，RNA 激活剂与每个目标mRNA 结合并独立启动mRNA 翻译。RNAPII-RNA polymerase Ⅱ（RNA聚合酶Ⅱ）Fig.3 CRISPReader drives gene expression by coupling the transcriptional and translational mechanisms［52］(a)CRISPReader is constructed by combining transcriptional and translational platforms.The dCas9-VP64 protein robustly activated transcription of reporter is constructed when combined with sgRNA targeting sequences near the TATA box.Then, the RNA activator leads to the formation of initiation factor complexes involving eIF4G and recruits ribosomes to initiate translation.(b) mechanisms of the CRISPReader designed to drive the gene cluster expression.After dCas9-VP64-mediated transcription, the RNA activators bind to each targeted mRNA and independently initiates mRNA translation.

6 基于CRISPReader 的微型基因线路（minigene）

通过将dCas9 与VP64（一个强转录激活域）融合，可以实现CRISPR 介导的转录激活［53］，在dCas9 的引导下，VP64 将转录元件招募到特定序列上，从而实现靶基因的转录起始激活或链延伸。Liu 等［52］通过调节sgRNA 间隔的长度，可控制Cas9-VP64 融合蛋白在转录激活和DNA 切割两种功能之间的切换：当sgRNA 间隔区长度为20 nt时，Cas9-VP64 可诱导DNA 切割断裂，而当sgRNA 间隔区长度为14 nt 时，Cas9-VP64 仅起转录激活作用，并且Cas9-VP64 的靶向特异性优于Cas9蛋白。

如图4 所示，首先将Cas9-VP64 引入基因线路，并删除膀胱组织特异性启动子UPII 和癌特异性启动子TERT 元件，仅保留相应的转录因子结合元件。结合已知TERT 启动子序列的肿瘤靶向转录活性主要由c-Myc 转录因子决定，而UPII 启动子序列的膀胱上皮组织特异性主要由Get1 转录因子调控。理论上讲，c-Myc和Get1仅在膀胱癌细胞中具有相对高的表达水平。初始表达后，sgRNA 可进一步与自身转录起始位点（TATA box）上游结合，并通过正反馈机制放大转录信号（c-Myc 和Get1）的激活效应，驱动其下游基因转录。Cas9-VP64/sgRNA2 进一步抑制LacI基因的表达，使荧光素酶报告基因被转录激活。在正常的膀胱上皮细胞中，荧光素酶不能被有效转录，并且在背景水平上被微量的LacI表达进一步沉默。从传统的基因线路中减少3.2 kb 的DNA 序列后，利用单个质粒载体将minigene 线路转染到细胞中（传统的基因线路需要多个质粒载体共转染）。质粒转染48 h后检测报告基因荧光素酶表达水平显示，正常细胞中荧光素酶表达泄漏在minigene 线路中几乎不存在，而在膀胱癌高恶性亚组中荧光素酶表达水平约为低恶性亚组的1.5 倍，这表明与传统基因线路相比，小基因线路对膀胱癌的识别灵敏度更高。将荧光素酶基因换为Bax、p21、E-cadherin 等抑癌因子的基因，进一步利用体内体外实验，测试线路对膀胱癌细胞的选择性识别及抑癌能力后发现，高度控制的微型基因线路相比传统逻辑线路和基因线路有更好的癌症诊断和抑癌效率［53］。这一研究工作为精准肿瘤治疗提供了一个应用工具，并可能为目前医学合成生物学应用的障碍提供一个潜在的有效解决方案。

图4 与门微型基因线路的设计与构建［54］（UPII启动子驱动Cas9 mRNA 的转录，而TERT 启动子用于促进靶向LacI的sgRNA 的转录。输出海肾荧光素酶基因受LacI控制的CMV 启动子调控。荧光素酶仅在UPII启动子和TERT 启动子都被激活时表达。在小基因线路的设计中，UPII和TERT 启动子被它们各自的转录因子结合元件取代。c-Myc 和Get1 仅在膀胱癌细胞中同时具有相对较高的表达水平。sgRNA1 和sgRNA2 初始表达后，它们可以进一步结合自身转录起始位点的上游，通过正反馈机制放大c-Myc 和Get1 的转录信号，分别放大下游基因的转录。此外，LacI 基因被sgRNA2 敲除，荧光素酶报告基因被转录激活。在正常膀胱上皮细胞中，荧光素酶不能被有效转录，并被在背景水平表达的痕量LacI进一步沉默）Fig.4 Design and construction of the AND gate minigene circuits［54］(The UPII promoter drives the transcription of Cas9 mRNA,while the TERT promoter is used to promote the transcription of sgRNA targeting LacI.The output Renilla luciferase gene is regulated by a LacI-controlled CMV promoter.The luciferase is expressed only when both UPII promoter and TERT promoter are activated.In the design of the minigene circuit,the UPII and TERT promoters are replaced by their respective transcription factor binding elements.Both c-Myc and Get1, only in bladder cancer cells, have a relative high expression level at the same time.After initial expression of sgRNA1 and sgRNA2, they could further bind to the upstream of their own transcription initiation sites, and amplify the transcription signals of c-Myc and Get1 through the positive feedback mechanism to amplify their downstream gene transcription.Furthermore,the LacI gene is knocked out by sgRNA2, and luciferase reporter gene is activated by transcription.In normal bladder epithelial cells, luciferase could not be effectively transcribed and further silenced by a trace amount of LacI expressed at the background level.)

7 靶向线粒体DNA 的CRISPR/Cas工具

线粒体DNA（mtDNA）序列的变异在肿瘤中很常见，线粒体基因型的细微变化会对细胞核、癌发生和进展产生深远的影响［55-56］。CRISPR/Cas9在核基因编辑方面取得了快速进展，其应用涉及gRNA 引导Cas9 至待编辑DNA 区域，由于线粒体缺乏输入RNA 的能力，如何将RNA 引入线粒体等问题限制了CRISPR/Cas9 系统在线粒体基因编辑应用的可行性和有效性。

2015 年首次报道CRISPR/Cas9 系统成功应用于线粒体基因编辑［57］。然而，该研究结果与另一研究存在一些争议。首先，gRNA 引入线粒体的机制尚不明确。20 个核苷酸茎环系列来自H1 RNA（RNase P enzyme RNA component）［58］，它附着在注入的细胞质RNA 上，可以成功地将RNA靶向到线粒体中。该方法对非编码RNA（如tRNA）和编码蛋白质的mRNA 均有效，为在CRISPR/Cas9 系统中将gRNA 导入线粒体提供了思路。Gammage 等总结了现有的RNA 导入理论，他们否认mtRNase P 中存在RNA 成分，认为RNase P 和RNase MRP 主要在细胞核中发挥作用，并质疑线粒体核糖体在协助rRNA 和PNPase 在细胞质RNA 运输中的作用［59］。也有报道称，酵母胞质tRNALys（CUU）的两个结构域F-arm 和D-hairpin［60］，以及5S RNA 的一些结构域也可能帮助RNA进入线粒体［61］。

由于线粒体中只存在同源重组（HR）修复途径，缺乏非同源末端连接（NHEJ）修复，利用CRISPR/Cas9系统产生双链断裂（DSB）和支持同源互补的外源DNA 片段，已成功在人和斑马鱼线粒 体［62］、酵 母 线粒 体的mtDNA 中 插 入DNA 序列［62］。过去，由于膜电位、pH 和噬菌体的吞噬作用，DNA 对线粒体的渗透面临很大困难［63］。近年来， 用DNA 包 被 钨 颗 粒、 DQAsome （ 由dequalinium 制成的阳离子囊泡）/DNA 复合物和TAT（trans-activator of transcription protein）等方式修饰的DNA，加载至基因枪对细胞进行轰击，成功实现了外源DNA进入酵母的线粒体［61］。

另一项研究利用MTS 修饰腺相关病毒衣壳VP2 并成功将ND4 基因转运到线粒体中，为线粒体递送DNA 序列提供了一种新方法［64］。其他用于药物或蛋白质的线粒体输送系统是通过金属有机物开发的框架（MOF）或三苯基膦（TPP）和细胞穿透聚（二硫化物）（CPD）修饰的可生物降解二氧化硅纳米粒子（BS-NPs），它们有可能用于外源性DNA 或RNA 成 分 的 线 粒 体 递 送［65-66］。在Bian等［67］的研究中，在体外用MTS 和转录物修饰Cas9，然后将gRNA和体外转录产物显微注射到细胞质中；他们还通过ViaFect 转染引入了含有同源臂的外源DNA 载体。令人惊讶的是，具有短同源臂的外源ssDNA 被准确敲入了靶向位点，这种诱变可以稳定地传递给F1 代斑马鱼，这表明ssDNA和gRNA可以不加修饰地转运到线粒体中，这与最近的研究一致［68］。

8 基于CRISPR/Cas9基因线路的挑战与展望

CRISPR/Cas 系统已成为合成生物学领域的重要工具，但其局限性不容忽视。当dCas9蛋白发挥其转录激活或转录抑制作用时，它通常与转录激活因子（VPR）或转录抑制因子（KRAB）融合以增强功能，而dCas9-VPR/KRAB 的体积大于现有病毒载体容量，这导致CRISPR/dCas9 系统在现实中的应用受到限制。因此，开发高效的递送途径是临床治疗前应解决的重要问题。

腺相关病毒（adeno associated virus，AAV）在临床治疗疾病已多年，具有良好的递送效率和相对较高的安全性［69］。AAV 作为稳定的辅助物存在，不会整合到宿主细胞的基因组中。过去几年，AAV 在动物体内进行基因转移的能力已经得到证实，包括人体靶组织，如肝脏、视网膜、心脏、肌肉和中枢神经系统［70-71］。因此，AAV 仍然是用于恶性肿瘤细胞基因治疗的常用载体。研究者正在努力寻找较小的Cas蛋白，例如空肠弯曲杆菌中Cas13d（仅1000 个氨基酸），以适应AAV 递送系统。

溶瘤病毒是一种减毒或工程化病毒，可因选择性复制而导致癌细胞裂解，并引发系统免疫反应，已被认为是一类癌症免疫治疗药物［72］，同时也是癌症治疗有前途的替代载体。有研究利用溶瘤腺病毒作为载体递送靶向EGFR 的CRISPR/Cas12a 系统，以破坏肿瘤细胞增殖信号通路，从而实现精确和癌症特异性基因组重编程和有效的肿 瘤消 退［73］。 利 用重 组溶 瘤 黏液 瘤病 毒（oncolytic myxoma virus，MYXV）递送诱导型CRISPR 靶向RAS基因，也显著降低了胚胎横纹肌肉瘤细胞的增殖［74］。虽然许多溶瘤病毒单独只引起微弱的免疫反应，但通过编码和局部释放细胞因子和趋化因子，可以大大增强溶瘤病毒对肿瘤的治疗效果，这有助于克服肿瘤微环境中的免疫抑制，与免疫调节剂的系统给药相比，副作用更小。Xie 等［75］利用microRNA 开关构建的基因线路，进一步提高溶瘤病毒的癌症靶向特异性，并在癌症微环境中成功触发了针对癌细胞的免疫反应。

2021 年8 月张锋研究团队［76］开发了一种全新的RNA 递送平台--SEND（selective endogenous ncapsidation for cellular delivery），其核心是一种逆转录病毒样蛋白PEG10，它能够与自身的mRNA结合并在其周围形成球型保护囊。研究团队将其改造设计后用来包装和递送RNA。PEG10 是逆转录转座子衍生蛋白质的其中一种，可形成类似于病毒的结构，优先结合并促进其自身信使RNA（mRNA）的囊泡分泌，并能够在细胞之间转移RNA。而且，PEG10 所携带的mRNA 可以被与PEG10 的非翻译区域和相关RNA 的侧翼基因重编程。利用这种可重编程性，设计了小鼠和人类PEG10 来包装、分泌和递送特定的RNA，用PEG10 蛋白实现了对Cas9 mRNA 以及sgRNA 的包装，并对人类细胞和小鼠细胞基因组的目标位点均成功实现了基因编辑。通过改造PEG10 蛋白的RNA 包装组件和识别组件，理论上能针对不同疾病提供模块化的治疗平台。

另一方面，Cas9 等外源蛋白在人体中使用的安全性也不容忽视。自问世以来，脱靶一直是Cas9 编辑哺乳动物细胞的潜在问题。提高CRISPR/Cas 的保真度可增强基因线路的可靠性，并最大化地减少副作用。Doudna 等［77-79］通过设计一种开关，使CRISPR/Cas9 完成编辑后失活，从而减少CRISPR 技术的脱靶效应。研究者未来还可利用定向进化和理性设计等方法改善碱基编辑系统，以实现理想的、宽度可窄至单个核苷酸的靶向窗口，甚至达到100%的碱基替换效率。

目前，基于CRISPR/Cas 的哺乳动物基因工具和基因线路正用于越来越宏大的目标，最大限度地提高CRISPR/Cas 系统的保真度以及递送效率将对该领域的发展作用巨大，使用CRISPR 技术的智能化基因线路将成为未来肿瘤基因治疗领域的一个重要方向。