四川山地乌骨鸡粪源大肠杆菌耐药性分析

何晴 汪熙来 鲁志平* 唐利军 成杰 邬旭龙 巫德胜 唐书宇 李建臻 郭英博 罗俊林 陈泽林 杨定勇

（1，成都农业科技职业学院 611130；2，四川省大英县农业农村局 629300）

大肠杆菌又名大肠埃希氏菌，属于人与哺乳动物胃肠道细菌中的一个共生寄栖菌。在某些特定条件下导致畜禽发病，并造成较大的经济损失，同时，大肠杆菌可随着人或动物的排泄物排出体外而直接污染环境。大肠杆菌病对畜禽养殖业由较严重的危害，主要疾病有猪大肠杆菌病、禽大肠杆菌病、兔大肠杆菌病等。大肠杆菌同时也是耐药性基因的传播载体。许多发达国家为了有效控制各种细菌耐药性，建立了各种细菌耐药性情况监测调度系统。对四川山地乌骨鸡群粪源大肠杆菌病的耐药性情况进行定期调查，有利于为四川山地乌骨鸡疫病防治和细菌耐药性监测提供一个较为理想的科学研究模型[1]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

营养琼脂、营养肉汤、麦康凯琼脂培养基、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管、革兰氏染液、20 种抗菌药药敏纸片及每片的含药量(单位：μg/片)，分别为青霉素类：青霉素(P，10)、哌拉西林(PIP，100)、羧苄西林(CB，100)、氨苄西林(AM，10)、苯唑西林(OX，1)；氨基糖苷类：庆大霉素(GM，10)、新霉素(N，30)、卡那霉素(K，30)、丁胺卡那(AK，30)；头孢菌素类：头孢唑啉(CZ，30)、头孢呋辛(CXM，30)、头孢曲松 (CTR，30)、头孢他啶(CAZ，30)、头孢哌酮 (CFP，75)、头孢拉定(RAD，30)、头孢氨苄(CA，30)；四环素类：米诺环素(MI，30)、多西环素(DX，30)、四环素(TE，30)；大环内酯类：红霉素(E，15)；以上材料均购于杭州微生物试剂公司。

1.2 样品采集

1.2.1 采样区域

成都农业科技职业学院四川山地乌骨鸡养殖场(A 场) 和遂宁市大英县四个不同的四川山地乌骨鸡养殖场(B、C、D、E 场) 采集样品。

1.2.2 粪样收集

采用随机取样法对每场按四川山地乌骨鸡养殖量10%进行采样，并分别编号后置于10ml 灭菌EP 管中避光冷藏运输，24h 内进行相关处理[2]。

1.3 细菌的分离与纯化

将无菌采集的四川山地乌骨鸡泄殖腔拭子置于无菌生理盐水中浸泡10～15min，在灭菌普通营养肉汤培养基中加入200μL浸泡液，37℃连续培养16～18h。用无菌接种环挑取少量菌液，用稀释涂布平板法均匀的涂布在麦康凯培养基上，在37℃无菌恒温箱连续培养24h，观察每个麦康凯培养基上菌落形态、特征情况[3]。挑取单个光滑粉红色菌落再经麦康凯培养基进行纯化处理，用革兰氏染色液染色、镜检，观察菌落染色形态及特征，根据染色鉴定结果对分离菌进行初步鉴定；将符合大肠杆菌特点的菌落接种于营养琼脂平板上，37℃下恒温连续培养24h 后，置于4℃冰箱中保存备用。

1.4 细菌鉴定

用肠杆菌科系列专用细菌生化编码微量反应鉴定管对已分离的大肠杆菌疑似物进行生化鉴定。将分离的各疑似大肠杆菌细菌液均匀接种于系列细菌生化编码微量反应鉴定管，在恒温箱中37℃进行培养，24h 后观察结果。对所有反应结果均进行生化编码，根据生化编码反应值检测搜索肠杆菌属各科中的细菌生化顺序编码反应表格后即可直接获得反应结果。对不确定性的菌种则可进行接种补充生化编码反应进行鉴定。并将经过鉴定后的大肠杆菌科的菌落全部接种到普通肉汤培养基中进行富集。

1.5 药敏试验

采用CLSI 推荐的K-B 法进行药敏试验。取纯化后的大肠杆菌菌液，用涂布接种法，将其均匀地涂布于普通琼脂平板表面，37℃培养18～24h，观察药片周围有无抑菌圈，并用游标卡尺测量药片的抑菌圈直径(取平均值)。试验结果判定：每个药片周围抑菌圈直径0≥20mm 为高度敏感，抑菌圈直径15≤d＜20mm 为中度敏感，抑菌圈直径10≤d＜15mm 为低度敏感，抑菌圈直径0≤d＜10mm 耐药。

2 结果

2.1 细菌分离与鉴定

大肠杆菌病的疑似物在麦康凯平板上的表现形态为边缘整齐、表面光滑、湿润且不透明、微带粉红色扁平状的菌落，见图1。经革兰氏染色，镜检呈现粉红色、两端钝圆、粗短的小杆菌。根据肠杆菌科细菌生化鉴定编码微量鉴定管进行细菌生化编码鉴定，按生化编码值检查搜索肠杆菌科细菌生化鉴定编码微量表，表明分离菌株为大肠埃希氏菌。

图1 分离菌在麦康凯平板上菌落特征

2.2 药敏试验

（1）用K-B 法对所鉴定的大肠杆菌菌株进行20 种常用抗生素的药敏联合试验，分析结果表明，A 场粪源大肠杆菌对20种常用抗菌药物具有高度敏感占15%，中度敏感占25%，低度敏感占10%；B 场中对抗菌药物具有高度敏感占10%，中度敏感占20%，低度敏感占10%；C 场中对抗菌药物具有高度敏感占10%，中度敏感占10%，低度敏感占15%；D 场中对抗菌药物具有高度敏感占35%，中度敏感占20%，低度敏感占10%；E场中对抗菌药物具有高度敏感占5%，中度敏感占5%，低度敏感占15%。

（2）分离的大肠杆菌对四环素、多西环素、氨苄西林、苯唑西林、羧苄西林、头孢曲松、卡那霉素的耐药率高达100.00%；而对盐酸头孢哌酮、头孢呋辛、头孢拉定、头孢唑林、头孢氨苄、哌拉西林、庆大霉素的耐药率在20%～80%之间；对头孢盐酸钠和头孢他啶、新霉素、丁胺卡那、米诺环素的耐药率均在20.00%以下。结果见附表，图2。

图2 粪源大肠杆菌的耐药结果

附表 不同养殖场大肠杆菌药敏结果统计表（单位：mm）

（3）试验表明，监测的四川山地乌骨鸡养殖场对多种不同类别抗生素耐药，并且部分养殖场耐药菌株呈现多重性耐药，A、B、D 场对头孢菌素类药物使用规范，C、E 场对头孢菌素类药物使用不规范；B、D 场对氨基糖苷类药物使用规范，A、C、E 场的用药规范有待提高；A、C、D、E 场对米诺环素使用规范，B 场米诺环素过度使用；A、C、D 场对哌拉西林比较有规范。5 个养殖场中，A 场和D 场对抗生素的使用较合理规范，B 场次之；C 场和E 场对抗生素的合理使用有待提高。

3 讨论

目前，大肠杆菌病再次成为畜禽生产中常见细菌性疾病之首，发病率逐年攀升，造成畜禽死亡率居高不下[4]。多个研究表明，细菌耐药性可能从动物通过食物链、环境或者动物和人的直接接触而传播[5]。不同品种动物的致病菌对各种新型抗菌生物治疗类药物敏感性程度可能也会存在较大差异，在选择和使用各种新型抗菌药物对其进行抗菌治疗时，需特别注意不同病原菌耐药性的定期检测。

养鸡场一旦发生大肠杆菌病，首先要进行药物敏感性试验，筛选出两种及以上对病原菌敏感的抗菌药物，选择几种比较敏感的抗菌药物同时进行使用或轮换使用，大大减少单一种药物的使用持续时间，有效实现在临床上的合理化和规范化用药，有效减缓各种细菌产生耐药性[6]。A 场和D 场在日常用药过程中一直采用敏感药物筛选等技术，对抗生素的使用较合理规范，多种抗生素均敏感或较敏感。

调查发现，四川山地乌骨鸡养殖生产中养殖舍饲养环境、卫生质量高，饲养人员、车辆、禽舍、用具的清洁消毒处理频率高，育雏期饲养密度及保温措施适当，饲料无污染且营养合理全面等，病原菌耐药性也随之降低，和本试验结果高度一致。