非洲猪瘟基因缺失株和非缺失株荧光定量PCR 检测方法的建立

雷宇平 图门巴雅尔 张仲萍 孙杰 宁艳 王锦 张昱 胡明明 王治维 赵凯 王仲兵

（山西省动物疫病预防控制中心 030027）

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是一种烈性病毒感染性疾病，在野猪和家猪中均可发病，其病原为非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）。早在18 世纪20 年代，Kenya 首次报道了该病毒引起的疫病[1]。目前，世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）将ASF 列为法定上报疫病，我国将其列为一类动物疫病[2]。非洲猪瘟疫情的流行不仅给养猪产业造成巨大的经济损失，而且对公共卫生安全也造成风险和威胁[3]。因此，了解非洲猪瘟的流行病学情况可为防控疫情、减少经济损失和保护畜牧业健康发展提供有力的科学依据。

ASFV 是一种双链DNA 病毒，是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，也是唯一通过节肢动物非洲钝缘蜱传播的DNA 病毒[1]。ASFV 的分子结构十分复杂，是有外壳的二十面体，平均直径约200nm。病毒基因组含有一个线性、共价键结合的双链DNA，长度约170～190Kbp，编码约151～167 个开放阅读框，包括一个保守中心和两段可变区，该可变区可编码5 种多基因家族，与病毒可变性密切相关[2,4]。

ASF 的自然窗口期通常为4～19d，急性期为3～4d。通常来说，ASF 的临床表现诊断可分为4 种病程形式，即超急性、急性、亚急性和慢性。其中超急性和急性非洲猪瘟热是由高致病力的毒株引起，亚急性和慢性非洲猪瘟热是由中至轻度致病力的毒株引起。超急性感染常发生猝死，临床表现较少；急性感染常表现为高热（达40.5～42℃），早期白细胞和血小板减少，心率和呼吸频率增快，耳朵、尾巴、四肢远端、胸部和腹部的皮肤发红，死亡前24～48h 出现贫血、发绀等症状，家猪病死率常达100%[5]。亚急性和慢性病程表现较为缓和，发热程度较轻，可出现皮肤坏死、溃疡和关节炎，亚急性自然病程在15～45d 死亡，慢性则在2～15 个月死亡[2]。根据ASFV 毒株致病力的不同，ASF 的临床表现和病程呈较大的个体差异，可表现为长期持续感染，也可表现为致死率100%的超急性和急性病程[6]。我国于2018 年爆发非洲猪瘟疫情，对我国养猪产业造成巨大影响，个别省份猪肉大规模减产。因此，建立一种灵敏、准确且快速检测不同ASFV 的毒株方法对收集非洲猪瘟疫情流行病学数据、对疫情形势做出正确判断至关重要。

1 材料与方法

1.1 核酸和样品

国家标准品非洲猪瘟病毒B646L 基因质粒（GBW (E)091034）作为阳性对照，无菌无核酶水作为阴性对照。参考品非洲猪瘟病毒P27 基因质粒、非洲猪瘟CD2v 基因缺失质粒和非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失质粒均购自广州艾基。

1.2 试剂和仪器

ddH2O（上海生工）、dNTPS（上海生工）、Hot-start Taq聚合酶（菲鹏生物）、5×buffer（菲鹏生物）、非洲猪瘟引物F1（上海生工）、非洲猪瘟引物R1（上海生工）、非洲猪瘟Taqman 探针P1（上海生工）、非洲猪瘟CD2v 基因缺失引物F2（上海生工）、非洲猪瘟CD2v 基因缺失引物R2（上海生工）、非洲猪瘟CD2v 基因缺失Taqman 探针P2（上海生工）、非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失引物F3（上海生工）、非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失引物R3（上海生工）、非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失Taqman 探针P3（上海生工）。NanoDrop 微量分光光度计（赛默飞）、速低温离心机（珠海黑马）、LightCycler480 荧光PCR 仪（瑞士罗氏）、小型瞬时离心机（美国精骐）、涡旋振荡器。

1.3 引物和探针设计

对比Genbank 上下载序列，各设计一对非洲猪瘟、非洲猪瘟CD2v 基因缺失和非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失的特异性引物和Taqman 探针，用于非洲猪瘟、非洲猪瘟CD2v 的鉴别检测，引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，参见表1。

表1 引物和探针

1.4 荧光PCR

病毒总DNA 按照核酸提取试剂（广州维伯鑫）说明书要求提取，再使用NanoDrop 微量分光光度计（赛默飞）通过检测样本在260nm 波长的吸光度来确定所提取的DNA 浓度。将提取的病毒DNA 逆转录为cDNA，使用LightCycler480 荧光PCR 仪（瑞士罗氏）加入设计好的引物R1、R2、R3 和各自的探针以cDNA 为模板分别进行扩增。反应体系如表2 所示。反应程序为42℃，20min；95℃，10min；94℃，15s，55℃，30s（收集荧光），共40 个循环。

表2 荧光PCR 反应体系

1.5 敏感性（最低检测限）检测

参考品加入0.5ml 无DNA 酶的去离子水复溶，待液体完全澄清后作为待测样品使用。参考品复溶后浓度为1.3×106copies/ml，分别用无DNA 酶的去离子水进行1:10（浓度为1.3×105copies/mL）、1:102（浓度为1.3×104copies/ml）、1:103（浓度为1.3×103copies/ml）、1:104（浓度为1.3×102copies/ml）及1:105（浓度为1.3×101copies/ml）5 个浓度梯度的稀释，作为待测样品用荧光PCR 方法对最低检出限进行检测。

1.6 精密性检测

使用参考品加入无DNA 酶的去离子水稀释100 倍后利用构建的荧光PCR 反应体系重复检测10 次，计算其CV 值。

1.7 特异性检测

采用非洲猪瘟国家参考品作为阳性对照，参考品恢复至室温，阳性、阴性参考品加入2.5 ml 无DNA 酶的去离子水复溶，待液体完全澄清后作为待测样品使用。

1.8 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 26 对重复性检测试验中的变异系数（Coefficient of Variance,CV）进行计算，CV≤5%表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 敏感性结果

将参考品病毒核酸按1:10、1:102、1:103、1:104 及1:105倍数进行稀释后使用荧光PCR 方法检测。结果显示，该技术能在浓度为1.3×103copies/ml 及以上时检出非洲猪瘟病毒（图1）、非洲猪瘟CD2v 基因缺失病毒（图2）和非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失病毒（图3）及猪源性内参（图4）。

图1 荧光PCR 体系最低检测限结果（非洲猪瘟病毒参考品）

图2 荧光PCR 体系最低检测限结果（非洲猪瘟CD2v 基因缺失病毒参考品）

图3 荧光PCR 体系最低检测限结果（非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失病毒参考品）

图4 荧光PCR 体系最低检测限内参结果（绿色线）

2.2 精密性结果

为检测本研究所构建的荧光RT-PCR 体系能否稳定的检测出不同病毒毒株，使用该技术分别重复检测非洲猪瘟病毒（表3 和图5）、非洲猪瘟CD2v 基因缺失病毒（表3 和图6）和非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失病毒（表3 和图7）的参考品各10 次，并计算其CV 值。经计算得出非洲猪瘟病毒的CV%为0.55%，非洲猪瘟CD2v 基因缺失病毒的CV%为0.36%，而非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失病毒的CV%为0.21%，三者的CV%均＜1%，提示该方法能重复稳定检测不同病毒毒株。

表3 精密度检测结果

图5 非洲猪瘟病毒精密性检测结果

图6 非洲猪瘟CD2v 基因缺失病毒精密性检测结果

图7 非洲猪瘟MGF360-505R 基因缺失病毒精密性检测结果

2.3 特异性结果

明确该方法的精密度后，利用国家标准品ASFV B646L 基因质粒做阳性对照，检测区分不同病毒毒株的特异性（图8）。与阳性对照相比，该技术测得的10 个非洲猪瘟病毒参考品全部为阳性，灵敏度为100%（10/10）。

图8 使用国家标准品作为阳性对照测得的特异性结果

另外，我们利用阴性参考品检测该方法的特异度（图9）。与阴性对照相比，该技术测得的20 个阴性参考品样本全部为阴性，特异度为100%（20/20）。

图9 使用阴性参考品作为对照测得的特异性结果

3 讨论

非洲猪瘟是一种传染速度快、致死率高的严重疾病。本研究建立了一种荧光PCR 方法，能灵敏、准确且快速检测不同的ASFV 毒株，能协助收集流行病学数据，有利于降低ASFV感染造成的经济损失，同时保护公共卫生安全。

2018 年8 月，我国沈阳确诊第一例非洲猪瘟疫情，截至2021 年12 月，全国共发生195 起非洲猪瘟疫情，其中家猪疫情189 起，野猪疫情6 起。2021 年以来，全国累计报告发生14起非洲猪瘟疫情。目前，人们已尝试了多种方法制备ASFV 的疫苗均未获得成功，无法在动物体内建立有效的保护性免疫，同时也缺乏有效的治疗方法[3]。现今，主要采用扑杀感染动物、严格生物安全措施等成本高、效率低的手段，为阻止疫情在我国乃至全球的蔓延。为了更好地应对非洲猪瘟对我国畜牧经济的影响、减少带病猪肉流入食品加工领域，我国针对ASFV 的实验室诊断技术分别制定了一个国家标准《非洲猪瘟诊断技术》 GB/T 18648-2018[7]、一个商检行业标准《非洲猪瘟检疫技术规范》 SN/T 1559-2010[8]和一个团体标准《非洲猪瘟病毒实时荧光PCR 检测方法》 T/CVMA 5-2018[9]。但根据ASFV 毒株致病力的不同，ASF 的临床表现和病程呈现较大的个体差异。因此，早期诊断、快速检测不同ASFV 病毒毒株、不断更新迭代病毒检测方法对疾病源头防控具有重要的意义。

病原体本身采取的检测方法是诊断ASFV 初期感染的有效手段，有助于疾病早期确认ASFV 感染，尽早确诊并进行干预处理[10]。荧光PCR 是指在反应体系中加入荧光基团和荧光淬灭基团，随着PCR 反应的进行，扩增产物不断积累，荧光信号逐渐增强，从而能利用较少的样本检测出准确的量化结果，是对原有PCR 技术的一大变革[11]。在本研究所建立的方法中，通过敏感性检测测得对不同毒株的最低检测限都较低，提示本研究方法有较高的灵敏性，能检出较低浓度的病毒水平。同时，养猪场环境复杂，采样过程难以达到标准化。经过重复性检验，重复10 次检测后CV%均＜1%，提示本研究建立的方法精密度佳，检测体系稳定可靠。另外，考虑到标本可能混入其他病毒样本或混合其他杂质，我们采用无菌无核酶水及国家标准品作为阴性和阳性对照，结果发现本方法可以准确地将不同ASFV 毒株检出，未出现假阳性或假阴性的情况，提示该检测方法特异性高，可在实践工作中避免各种干扰因素影响。总体而言，有效的诊断方法能尽早将不同病毒毒株检出，降低运输、屠宰、生产加工等下游各环节疫情传播风险，降低成本支出，提高经济受益。

综上所述，本研究建立的荧光PCR 技术能快速准确地鉴定ASFV 的不同毒株，为疫情防控提供流行病学依据。