β-catenin和YAP通路在Klotho蛋白调节硫酸吲哚酚诱导巨噬细胞极化中的作用

李颖 陈进 吕晶 严飞

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在不同微环境中被极化为具有不同功能的M1和M2两种类型。巨噬细胞极化在包括肾纤维化在内的多种疾病发生、发展中发挥重要作用。本课题组曾报道硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）能够促进THP-1源巨噬细胞M1极化，而Klotho蛋白通过NF-κB、p38-MARK通路显著抑制M1极化并强化M2极化[1-3]。本研究通过构建Klotho过表达质粒，转染THP-1源巨噬细胞，进一步探讨β-连环蛋白（β-catenin）和Yes相关蛋白（Yes associated protein，YAP）通路在Klotho蛋白调节IS诱导巨噬细胞极化中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 THP-1细胞（上海复祥生物科技有限公司）；pIRES2-ZsGreen1质粒（广州复能基因有限公司）；IS（上海甄准生物科技有限公司）；HLADR抗体、CD206抗体、GAPDH抗体（美国Abcam公司）；RNeasy MiniKit试剂盒（德国 Qiagen公司）；cDNA反转录试剂盒（美国Applied Biosystems公司）；βcatenin 抗体、磷酸化 YAP（phospho-Yes associated protein，p-YAP）抗体（美国 Affnity公司）；YAP抗体（美国Novus公司）；YAP1抗体（美国 Proteintech公司）；HRP二抗（德国Dianova公司）；ECL显影液（美国Bio-Rad公司）；0.1%Triton X-100（南京森贝伽生物科技有限公司）；GelDoc成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养及诱导 THP-1细胞用含有10%FBS的RPMI 1640培养基在37℃、5% CO2条件下培养，并维持2×105/ml浓度。经丙二醇甲醚醋酸酯（propylene glycol methyl ether acetate，PMA）（160 nM）处理 48 h诱导成THP-1源巨噬细胞。

1.3 质粒构建及细胞转染和分组 利用本课题组成功构建的Klotho过表达质粒转染THP-1源巨噬细胞[1-2]。根据Klotho目的基因序列GenBank：NM-004795.3，设计引物PCR目的条带，获取目的片段。小量提取pIRES2-ZsGreen1质粒，与胶回收Klotho PCR产物混匀，离心，双酶切，37℃过夜。回收酶切的pIRES2-ZsGreen1质粒和Klotho基因片段，混匀，离心，采用T4 DNA连接酶，4℃过夜快速连接。钙离子处理后的感受态THP-1细胞解冻后，加入重组连接产物，复苏。根据转染质粒及是否用IS干预，细胞分为4组：（1）对照组：转染未经处理的pIRES2-ZsGreen1质粒；（2）对照+IS组：转染未经处理的pIRES2-ZsGreen1质粒，并参照既往研究结果予 IS（2 mmol/L）干预[1]；（3）过表达组：转染 Klotho过表达质粒；（4）过表达+IS组：转染Klotho过表达质粒并予IS（2 mmol/L）干预。最后收集适量的细胞，进行样本制备。

1.4 M1极化标志物HLA-DR和M2极化标志物CD206阳性细胞百分比检测 采用流式细胞术。细胞离心重悬后计数，每管含1×106个细胞；离心后以含0.5%牛血清白蛋白的PBS孵育缓冲液清洗2遍，每管用0.2 ml PBS孵育缓冲液重悬，添加5 μl HLA-DR或CD206抗体，4℃避光孵育30 min；离心后再次清洗、重悬，上流式细胞仪检测。结果以阳性荧光百分比表示。

1.5 β-catenin和YAP mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR法。根据RNeasy MiniKit试剂盒说明书提取RNA并对DNase进行消化。使用大容量cDNA反转录试剂盒进行cDNA合成，反应条件如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存；qRT-PCR实验利用SYBR Green实验方法中Step One Plus Real-Time PCR系统进行，反应条件如下：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环，所有实验重复3次，以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCT法进行各基因表达的相对定量。相关引物序列：β-catenin上游引物：5'-CCAAGTGGGTGGTATAGAGG-3'，下游引物：5'-AGTCCATAGTGAAGGCGAAC-3'；YAP 上游引物：5'-GTGGCACCTATCACTCTCGA-3'，下游引物：5'-TGGCTTCAAGGTAGTCTGGG-3'。

1.6 β-catenin、YAP和 p-YAP蛋白表达水平检测采用Western blot法。由于YAP磷酸化是YAP信号通路的关键环节，故采用Western blot法检测p-YAP蛋白表达水平。用含有蛋白酶抑制剂的裂解液裂解细胞，收集上清液提取蛋白质，利用Bradford法测量蛋白浓度。取10 μg细胞裂解液通过凝胶电泳分离，转膜，漂洗，用含4%牛奶的封闭液封闭后加入β-catenin抗体（1∶1 000）、YAP 抗体（1∶1 000）、p-YAP 抗体（1∶1 000）、GAPDH 抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜。用含0.1%Tween的PBS溶液将膜洗3遍后，加入含4%牛奶的封闭液以及HRP二抗，在室温条件下孵育2 h，滴加ECL显影液并放入GelDoc成像系统进行拍照。蛋白表达水平用内参蛋白GAPDH进行归一化处理。

1.7 β-catenin、YAP入核率检测 采用细胞免疫荧光染色法。细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min，用含0.1%Triton X-100的PBS处理细胞15 min。封闭液孵育1 h，滴加一抗 β-catenin（1∶100），YAP1 抗体（1∶100），4℃过夜孵育，滴加二抗（1∶100），37℃避光孵育 1 h，DAPI进行复染5 min，荧光显微镜或激光扫描共聚焦拍照，计算β-catenin或YAP入核率。

1.8 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。以上每项实验至少重复3次。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组M1和M2极化标志物标记的阳性细胞百分比比较 与对照组比较，对照+IS组HLA-DR标记的阳性细胞百分比明显增加（P＜0.01），CD206标记的阳性细胞百分比无明显变化（P＞0.05）；与对照+IS组比较，过表达+IS组HLA-DR标记的阳性细胞百分比明显减少（P＜0.01），而CD206标记的阳性细胞百分比明显增加（P＜0.01），见图1和表1。

表1 各组M1和M2极化标志物标记的阳性细胞百分比比较（%）

图1 Klotho对IS诱导下THP-1源巨噬细胞M1和M2极化的调节（a：各组细胞M1极化情况；b：各组细胞M2极化情况）

2.2 各组细胞β-catenin mRNA及蛋白表达水平及入核率比较 与对照组比较，对照+IS组β-catenin mRNA及蛋白表达水平均明显降低（均P＜0.01）；而与对照+IS组比较，过表达+IS组β-catenin mRNA及蛋白表达水平均升高（均P＜0.05），见图2和表2。与对照组比较，对照+IS组β-catenin入核率明显下降（P＜0.01）；与对照+IS组比较，过表达+IS组β-catenin入核率增加（P＜0.05），见表2和图3（插页）。

表2 各组细胞β-catenin mRNA及蛋白表达水平及入核率比较

图2 各组细胞β-catenin蛋白表达的电泳图

图3 Klotho对IS诱导下THP-1源巨噬细胞β-catenin入核的影响

2.3 各组细胞YAP mRNA及蛋白表达水平及入核率比较 各组细胞YAP mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，对照+IS组YAP蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），p-YAP蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）；与对照+IS组比较，过表达+IS组YAP蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），p-YAP蛋白表达水平升高（P＜0.05），见图4和表3。与对照组比较，对照+IS组YAP入核率增加（P＜0.01）；而对照+IS组和过表达+IS组YAP入核率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3和图5（插页）。

表3 各组细胞YAP mRNA及蛋白表达水平及入核率比较

图4 各组细胞YAP及p-YAP蛋白表达的电泳图（a：各组细胞YAP蛋白表达的电泳图；b：各组细胞p-YAP蛋白表达的电泳图）

图5 Klotho对IS诱导下THP-1源巨噬细胞YAP入核的影响

3 讨论

巨噬细胞是单核吞噬细胞系统晚期分化细胞，是机体重要的免疫细胞，在维持机体稳态中发挥重要作用，按照其表型和分泌的细胞因子可分为M1和M2型两大类型。近年研究发现，巨噬细胞在肾纤维化中发挥重要作用，成为该领域研究的热点[4-5]。M1型巨噬细胞通过释放趋化因子、前炎症因子和活化氧等激活炎症反应，加速肾脏损伤；M2型巨噬细胞分泌大量抗炎因子抑制炎症反应，促进血管生成。因此，巨噬细胞适度M2极化有利于组织修复与重塑，而过度M2极化可能诱导巨噬细胞-肌成纤维细胞转化，最终导致肾纤维化[4-5]。

IS是慢性肾脏病患者血清中一种典型的蛋白结合毒素，常规透析方法难以清除，具有独特的物理化学性质和毒性反应，能够诱导巨噬细胞释放前炎症因子和趋化因子等，促进炎症反应发生[6-7]。Klotho蛋白主要在肾脏产生，可缓解炎症反应，诱导巨噬细胞M2极化，有助于肾脏损伤后修复[8-9]。随着肾脏疾病进展，血清Klotho蛋白水平进行性下降，使肾脏更易受到损伤并促进肾纤维化[10]。本研究显示，与对照组比较，对照+IS组HLA-DR标记的阳性细胞百分比明显增加，提示IS可促进THP-1源巨噬细胞发生M1极化；与对照+IS组比较，过表达+IS组M1型阳性细胞百分比明显减少，而CD206标记的M2型阳性细胞百分比明显增加，表明Klotho过表达可明显抑制IS诱导的M1型比例增加，并促进M2型比例增加。本团队进一步研究证实IS可显著抑制Klotho表达，Klotho通过NF-κB和p38-MARK通路下调IS诱导下的巨噬细胞M1极化，并促进M2极化[1-2]，与以往的研究结果一致。

Wnt/β-catenin通路是高度保守的信号传导通路，主要通过入核调节下游基因转录发挥作用，与巨噬细胞增殖、分化等密切相关[11]。IS可通过激活Wnt/β-catenin通路诱导血管平滑肌细胞钙化[12]、近曲小管上皮细胞上皮-间质转化[13]，进而加速肾纤维化进程[14]。而Klotho蛋白具有抑制肾小管上皮、心肌等细胞的Wnt/β-catenin通路，从而保护肾脏、心肌等组织，延缓多脏器纤维化的作用[15-17]。本研究显示，与对照组比较，对照+IS组β-catenin mRNA及蛋白表达水平均明显降低，表明IS可明显抑制细胞β-catenin通路信号分子表达；而与对照+IS组比较，过表达+IS组β-catenin mRNA及蛋白表达水平均升高，提示Klotho可以明显抑制IS诱导的β-catenin通路的改变。进一步研究发现与对照组比较，对照+IS组β-catenin入核率明显下降；与对照+IS组比较，过表达+IS组β-catenin入核率增加，表明IS可诱导细胞中β-catenin入核下降，Klotho对此过程具有抑制作用。此结果与既往的报道存在差异，可能与选择细胞类型不同等因素相关。不同细胞来源的Wnt配体均可诱导巨噬细胞M2极化[18-19]，在小鼠模型Wnt/β-catenin通路促进肾纤维化的过程中同样存在巨噬细胞聚集及M2极化[19]。本研究显示IS通过抑制β-catenin通路诱导巨噬细胞M1极化，Klotho蛋白通过缓解IS对β-catenin通路的抑制强化M2极化，与上述Wnt/β-catenin通路对巨噬细胞极化的调节作用基本一致。

YAP是Hippo信号通路下游的效应蛋白，在哺乳动物中，Hippo信号通路被激活后，使YAP磷酸化并滞留在胞质中，从而功能受到抑制；相反，通路抑制后YAP的磷酸化程度降低，非磷酸化的YAP进入细胞核与相关转录因子结合，最终启动目的基因的表达。YAP进入肿瘤细胞胞核后可诱导分泌IL-6、IL-4等细胞因子，使肿瘤相关巨噬细胞M2极化[20]，YAP1基因敲除或药物阻断结肠癌细胞YAP通路均能够显著抑制结肠癌相关的巨噬细胞M2极化[21]。本课题组曾报道IS可活化脂多糖刺激下巨噬细胞的YAP通路，从而增强炎症反应，诱导M1极化[3]，与上述结论存在差异。本研究发现各组细胞YAP mRNA表达水平比较差异无统计学意义，提示IS诱导和Klotho过表达质粒对YAP转录水平影响不大。与对照组比较，对照+IS组YAP蛋白表达水平明显升高，p-YAP蛋白表达水平明显降低；与对照+IS组比较，过表达+IS组YAP蛋白表达水平明显降低，p-YAP蛋白表达水平升高。胞内YAP蛋白水平变化明显，且与YAP磷酸化水平变化趋势相反，提示IS可以通过抑制YAP磷酸化来阻断YAP降解从而促进YAP的积累，Klotho则可解除IS对YAP磷酸化的抑制作用。进一步研究显示与对照组比较，对照+IS组YAP入核率增加；而对照+IS组和过表达+IS组YAP入核率比较差异无统计学意义，提示IS可以促进YAP入核，而Klotho对IS诱导下THP-1源巨噬细胞中YAP入核影响不大。从而证实Klotho虽可以调节IS诱导下的YAP磷酸化水平和蛋白含量，但对YAP入核作用不大。

总之，本研究证实Klotho蛋白可通过抑制IS诱导的β-catenin通路下调强化巨噬细胞 M2极化，对YAP通路中入核关键环节无显著作用。结果中有部分与以往报道存在差异，其相关机制有待于进一步研究证实。