自闭症模型小鼠神经递质水平病理性改变的机制研究

赵佳佳 赵蓓 高未 李杰 蔡俏 应小明

自闭症又称孤独症，是广泛性发育障碍的代表性疾病，核心症状主要包括情绪表达困难、社交互动障碍，语言和非语言的沟通障碍、限制行为与重复刻板动作以及明显的兴趣狭窄[1-2]。除上述三大核心症状外，自闭症患者还可能伴发其他临床症状，如智力障碍、癫痫、睡眠障碍、感知系统异常、头围异常、胃肠道不适、免疫及代谢异常等[3-4]。由于自闭症具有高度临床异质性和病因异质性，其真正的发病机制目前尚未完全清楚[5-6]。相关研究表明，自闭症的发生可能受到基因和环境因素的共同影响[7]。本文通过构建自闭症小鼠模型，对其神经递质[包括γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺等]水平病理性改变的机制作一探讨。

1 材料和方法

1.1 实验动物 12只雌性、6只雄性C57BL/6小鼠，6周龄，无特定病原体，购自上海斯莱克，SCXK（沪）2017-0005，合格证号：20170005047072。试验前小鼠在动物房环境中适应1周。饲养环境：温度20～25℃，相对湿度40%～70%。本实验委托杭州赫贝科技有限公司机构完成，实验方案经该公司动物实验伦理委员会审查通过。

1.2 主要试剂和仪器 高尔基染色试剂盒（批号：PK401）购自美国FD Neuro Technologies Inc公司，丙戊酸钠（sodium valproate，VPA；批号：K1823102）购自四川科瑞德制药股份有限公司，聚偏二氟乙烯膜（批号：IPVH00010）购自美国 Millipore公司，GABA（批号：14012）试剂盒购自美国 R&D公司，5-HT（批号：17101）试剂盒购自美国R&D公司，多巴胺（批号：14082）试剂盒购自美国R&D公司，Arc一抗（批号：H00023237-B01）购自艾美捷科技有限公司，EGR2一抗（批号：ab63943）购自上海恒斐生物科技有限公司，S-100a9一抗（批号：H00006280-M01A）购自艾美捷科技有限公司。水迷宫系统购自北京智鼠多宝科技有限责任公司，CM186UV型冷冻切片机购自德国Leica公司，BX43型电子显微镜购自日本Olympus公司，AB SCIEX 5500 QTRAP质谱仪购自美国AB SCIEX公司，1290 Infinity LC超高效液相色谱仪购自美国Agilent公司，5430R低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，Mini-Proten Tetra System电泳系统、ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪、定量PCR仪及配套的分析软件均购自美国Bio-RAD公司。

1.3 自闭症小鼠（子代）模型的建立 将健康成年雌鼠12只和雄鼠6只合笼，受孕后将雌鼠按随机数字表法分为模型组（母代）和对照组（母代），记为受孕0 d。模型组（母代）于受孕10、12 d腹腔注射VPA注射液（使用0.9%氯化钠注射液配置，浓度为250 mg/ml）1.2 ml/kg，对照组给予等体积0.9%氯化钠注射液。新生鼠出生当天记为出生0 d，模型组（子代）于出生4 d后进行母子分离实验。将新生小鼠移至远离亲本的新房间，分离24 h后将新生小鼠送回，与亲本同笼。建模8周后，取模型组（子代）、对照组（子代）各12只用于以下实验。

1.4 小鼠（子代）行为学观察 采用理毛实验、水迷宫实验和旷场实验。对照组、模型组小鼠（子代）各取3只进行行为学观察。（1）理毛实验：观察并记录小鼠5 min内的理毛次数。（2）水迷宫实验：将小鼠置于水迷宫中央区，记录小鼠搜寻站台的时间，即潜伏时间。（3）旷场实验：将小鼠置于50 cm×50 cm×50 cm的旷场装置中，测量小鼠5 min内的运动距离，记录某一肢体进入旷场中央格子的次数（即穿越格子次数）、后肢站立次数。

1.5 小鼠（子代）海马锥体神经元结构观察 采用高尔基染色法。对照组、模型组小鼠（子代）各取3只，断头处死，取脑组织并用纸巾轻轻擦拭，采用聚乙二醇包埋，置于-20℃冷冻切片，切片厚度100 μm，采用黏附载玻片贴片，避光，于30 min内进行高尔基染色。避光，蒸馏水洗2次，4 min/次；用吸水纸轻轻吸去多余水分，将工作液滴于组织上，室温下放置12 min，蒸馏水洗2次，4 min/次；不同乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。在电子显微镜下观察，胶质细胞的胞体呈棕黑色或黑色为神经元染色结果，使用Image系统计算锥体神经元数量。

1.6 小鼠（子代）脑皮层神经递质水平检测 采用高效液相色谱法。对照组、模型组小鼠（子代）各取3只，断头处死，取出脑皮层样本并分别称取60 mg进行实验。加入 800 μl甲醇乙腈溶液（1∶1，v/v），涡旋 60 s；低温超声30 min，共2次，-20℃放置1 h；14 000 r/min、4℃离心20 min，取上清液；冷冻干燥，-80℃保存样本。采用高效液相色谱法测定GABA、5-HT和多巴胺水平。

1.7 两组小鼠（子代）脑组织Arc、EGR2和S-100a9蛋白表达水平检测 采用Western blot法。对照组、模型组小鼠（子代）各取3只，断头处死，取0.1 mg脑组织，加入 500 μl裂解液，充分匀浆；4 ℃、11 000 r/min离心20 min，将上清液转移至新的1.5 ml离心管中，置于-80℃保存；采用BCA法测定蛋白浓度。配置十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳（先80 V 30 min，再120 V 60～70 min）；将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭1 h；过夜孵育一抗；TBST洗一抗；室温孵育二抗1 h；TBST洗二抗6～7次，6 min/次；曝光显色。蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.8 统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠（子代）理毛实验结果比较 模型组小鼠（子代）理毛次数为（25.67±6.51）次，明显多于对照组小鼠（子代）的（7.31±3.24）次，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 两组小鼠（子代）水迷宫实验结果比较 两组小鼠（子代）第1天潜伏时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而第 2、3、4、5天模型组小鼠（子代）潜伏时间均明显长于对照组小鼠（子代），差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 1。

表1 两组小鼠（子代）潜伏时间比较（s）

2.3 两组小鼠（子代）旷场实验结果比较 模型组小鼠（子代）总运动距离明显短于对照组小鼠（子代），且穿越格子次数、后肢站立次数均明显少于对照组小鼠（子代），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 两组小鼠（子代）旷场实验结果比较

2.4 两组小鼠（子代）海马锥体神经元结构比较 模型组小鼠（子代）较对照组小鼠（子代）的海马锥体神经元胞体萎缩，锥体神经元数量明显减少[（0.06±0.04）个/μm 比（0.32±0.11）个/μm]，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 1。

图1 两组小鼠（子代）海马锥体神经元高尔基染色所见（电子显微镜下，×1 000）

2.5 两组小鼠（子代）脑皮层神经递质水平比较 模型组小鼠（子代）脑皮层GABA、5-HT水平均高于对照组小鼠（子代），而多巴胺水平明显低于对照组小鼠（子代），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 两组小鼠（子代）神经递质水平比较（nmol/g）

2.6 两组小鼠（子代）脑组织 Arc、EGR2、S-100a9蛋白表达水平比较 模型组小鼠（子代）脑组织Arc、EGR2蛋白表达水平均高于对照组小鼠（子代），而S-100a9蛋白表达水平明显低于对照组小鼠（子代），差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2和表4。

表4 两组小鼠（子代）脑组织Arc、EGR2和S-100a9蛋白表达水平比较

图2 两组小鼠（子代）脑组织Arc、EGR2和S-100a9蛋白表达的电泳图

3 讨论

自闭症是一种神经系统发育障碍疾病，起病于婴幼儿期，一般在3岁前发病，严重影响儿童的健康，甚至对其成年后的学习、工作和生活均有深远影响[8]。近年来，自闭症患病率呈不断上升趋势[9]。新生儿出生后早期有一段特定时间窗，其大脑能非常敏锐地感知外界环境刺激并获取外部信息，这段时期为脑发育的关键期[10]。研究表明，在新生儿脑发育关键期的经历可以塑造大脑神经环路，对其成年后的认知、情感及行为均有影响[11]。生命早期应激被认为是多种精神疾病的重要风险因素。针对哺乳动物母婴关系在早期生长发育、学习认知和社交行为中的重要作用，早期母爱剥夺被认为是早期应激事件之一。根据灵长类动物以及人类的研究结果，早期母爱剥夺会影响个体的神经发育和行为表现，且这些影响可能持续一生[12]。新生幼鼠的早期生长主要依赖于母鼠所提供的温暖、营养与庇护，母婴联系在出生后2周内尤为重要。以啮齿类动物（大鼠、小鼠）母子分离实验模拟人类生命早期母子分离的特征，已成为研究早期经历影响个体发育的主要模型[13]。既往实验表明，早期母子分离可导致大鼠、小鼠行为学发生改变，这些改变呈现出自闭症类似行为，如经历早期母子分离的小鼠自发活动减少，社交行为受损，同时焦虑、抑郁类似行为明显增加[14-15]。

本实验建立了自闭症小鼠模型，结果表明与对照组小鼠（子代）比较，模型组小鼠（子代）理毛次数明显增多，第2、3、4、5天潜伏时间明显延长，总运动距离明显缩短，穿越格子次数及后肢站立次数均明显减少。这提示模型组小鼠（子代）存在社交障碍、探索能力异常等。此外，本实验结果显示模型组小鼠（子代）锥体神经元数量少于对照组小鼠（子代），提示模型组小鼠（子代）的海马锥体神经元胞体萎缩。在中枢神经系统中，突触传递最重要的方式是基于神经递质的神经化学传递。近年来研究发现，神经递质在神经系统疾病发病机制中的作用备受关注[16]，GABA、5-HT和多巴胺是重要神经递质指标。有研究发现，神经系统疾病患者发作期血液中GABA、5-HT水平均明显升高，而多巴胺水平明显降低[17]。本实验结果显示，模型组小鼠（子代）脑皮层GABA、5-HT水平明显升高，而多巴胺水平明显降低，提示自闭症模型小鼠存在神经递质水平改变。进一步检测脑组织Arc、EGR2、S-100a9蛋白表达水平发现，模型组小鼠（子代）Arc、EGR2蛋白表达水平明显升高，而S-100a9蛋白表达水平明显降低。这提示自闭症模型小鼠存在行为学异常和神经递质水平改变，可能与Arc、EGR2蛋白表达上调、S-100a9蛋白表达下调的机制有关，但有待后续研究作进一步证实。

综上所述，自闭症模型小鼠存在行为学异常和神经递质水平改变，可能与Arc、EGR2蛋白表达上调、S-100a9蛋白表达下调的机制有关。但本研究也存在一定的局限性，今后仍需开展多中心、多样本的研究，以提供更可靠的参考依据。