基于谱效分析评价电子束辐照灭菌对山银花药材质量的影响

徐远芳 彭 玲 李鹏辉 张祺玲 高美须 周毅吉李文革 邓钢桥,*

(1 湖南省农业科学院核农学与航天育种研究所/湖南省农业生物辐照工程技术研究中心/生物辐照技术湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410125；2 湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006；3 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

《中华人民共和国药典》自2005年版起将金银花分列为金银花和山银花，两种药材的基源不同，但药理作用相似[1-2]。山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand. -Mazz.)、红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、华南忍冬(LoniceraconfusaDC.)或黄褐毛忍冬(Lonicerafulvoto-mentosaHsu et S. C. Cheng)的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热的功效，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热[3]。山银花因产量高、易采收、花期长等特点而被大量种植，主产于我国湖南、广东、四川等南方地区[4]。山银花作为中医临床常用药材，是银翘解毒丸(片)、犀羚解毒丸(片)、银花口服液、维C银翘片等多种中成药的主要原料，同时也属于药食同源类原料。近年来，山银花还被广泛应用于食品、饮料、保健品、化妆品和兽药等领域，市场需求量逐年增加[5]。山银花含有绿原酸、黄酮、环烯醚萜、皂苷等多种活性成分[6-7]，现代药理学研究表明，山银花具有抗菌[8]、抗病毒[9]、抗炎[10]、抗氧化[11]、抗肿瘤[12]、护肝[13]及调节免疫[14]等功效。其中，绿原酸含量是山银花药材内在质量的标志，与价格、药用价值和临床疗效密切相关[15]。山银花中绿原酸含量明显高于金银花[16]。李泮霖等[17]研究发现山银花对口腔炎症因子的调控作用明显强于金银花，说明绿原酸含量与其药效密切相关。

山银花药材在贮藏过程中易出现虫蛀、霉变等问题，不仅浪费药材，造成经济损失，还可能使药材的药性发生改变，导致药材质量和疗效下降。传统的中药材贮藏养护方法包括硫磺熏蒸等化学方法以及干燥、气调贮藏等物理方法，但普遍存在化学残留、有效成分含量降低以及成本高等问题。因此，探索科学的贮藏养护方法对保障山银花药材质量具有重要意义。辐照灭菌是目前常用的中药灭菌方法之一，与传统的中药材灭菌方法相比，具有效果好、安全、高效、成本低等优点，尤其适用于含挥发性、热敏性中药材的灭菌[18]。60Co-γ射线和电子束是辐照技术应用的两种主要射线类型，目前已广泛应用于食品贮藏与保鲜等领域[19]。但电子束辐照在中药灭菌领域的基础研究较少，有关中药材电子束辐照灭菌的研究仅见于党参[20]、黄连[21]、贯叶金丝桃[22]等少数品种，且仅关注电子束辐照对中药材有效成分含量的影响，而对电子束辐照灭菌中药材质量控制技术缺少深入研究。

本研究以中药材山银花及其提取物为对象，采用不同剂量的电子束进行辐照处理，通过对其指标成分绿原酸含量和1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH·)清除率的测定、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)指纹图谱相似度评价及聚类分析(cluster analysis, CA)，利用谱效变化的分析方法评价电子束辐照灭菌对山银花及其提取物质量的影响，旨在为电子束辐照技术在山银花药材贮藏应用中的质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山银花，购自湖南省长沙市高桥中药材市场，经湖南省中医药研究院专家鉴定为忍冬科植物灰毡毛忍冬黄绿色干燥的花蕾。山银花提取物，其中绿原酸含量为5%，棕黄色粉状，购自长沙市惠瑞生物科技有限公司。

绿原酸对照品(96.8%)、木犀草苷对照品(93.5%)、芦丁对照品(91.7%)均购自中国食品药品检定研究院；DPPH，日本WAKO公司；胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)，美国SIGMA公司；甲醇、乙醇、磷酸等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

B3 WINdose辐照剂量计，美国GEX公司；IS1020电子束辐照加工系统(10 MeV/20 kW)，北京同方威视技术股份有限公司；Ultimate 3000高效液相色谱仪，美国Thermo Fisher公司；SB-5200D超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；SQP电子天平，德国Sartorius公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；SPX-250B生化培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；MJ霉菌培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；UV-2450紫外可见分光光度计，日本SHIMADZU公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品准备 采用PE自封袋分装，山银花和山银花提取物样品各15袋，每袋约50 g，用于微生物限度检查；2种样品各15 袋，每袋约100 g，用于DPPH·清除率、绿原酸含量以及HPLC指纹图谱检测，其中山银花经高速万能粉碎机粉碎后过60目筛。

1.3.2 电子束辐照 电子束辐照在湖南湘华华大生物科技有限公司进行，辐照过程用辐照变色薄膜剂量计进行剂量跟踪。试验辐照剂量分别设定为0、3、6、9、18 kGy，吸收剂量实测值分别为0、2.8、6.3、9.5、18.8 kGy，以上每个剂量设3个平行。样品辐照完成后即进行各项指标检测，所有指标均重复检测3次。

1.3.3 微生物限度检测 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检测参照2020年版《中华人民共和国药典》四部通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法[23]。

1.3.4 抗氧化活性测定[24]

1.3.4.1 DPPH乙醇溶液的制备 准确称取0.002 0 g DPPH置于50 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，避光保存，即得 0.1 mmol·mL-1DPPH溶液。

1.3.4.2 供试品溶液的制备 准确称取0.5 g样品粉末，置于具塞锥形瓶中，加入10 mL 60%乙醇溶液，65℃超声提取30 min，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液0.48 mL于50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，即得供试品溶液。

1.3.4.3 样品DPPH·清除率的测定 准确移取1 mL供试品溶液、4 mL DPPH溶液于试管中，摇匀，避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度值(A1)。准确移取1 mL供试品溶液与4 mL 60%乙醇于试管中，摇匀，避光反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度值(A2)。准确移取1 mL 60%乙醇溶液与4 mL DPPH溶液于试管中，摇匀，避光反应 30 min，于517 nm波长处测定吸光度值(A0)。按照公式计算样品DPPH·清除率：

DPPH·清除率=

[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.3.5 HLPC指纹图谱测定[3]

1.3.5.1 对照品溶液的制备 准确称取绿原酸、木犀草苷、芦丁标准对照品5.02、5.53、5.32 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得3种对照品溶液。

1.3.5.2 供试品溶液的制备 准确称取样品粉末0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL 50%甲醇溶液，称定重量，超声(功率300 W，频率40 kHz)提取40 min，取出，冷却，称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.3.5.3 HPLC色谱分析 Welchrom C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱，以乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相，按照表1的程序进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1， 柱温30℃，进样量10 μL，双波长检测，样品指纹图谱检测波长220 nm，绿原酸含量检测波长330 nm。

表1 流动相时间程序Table 1 The time program of mobile phase

1.3.5.4 指纹图谱采集 按前述方法分别制备对照品和供试品溶液，以50%甲醇溶液作为溶剂空白，精密吸取溶剂空白、对照品、供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪于波长220 nm处进行测定，即得HPLC指纹图谱。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 电子束辐照对山银花药材生物负载的影响

2020年版《中华人民共和国药典》中明确规定了非无菌药用原料及辅料、中药提取物的微生物限度标准，即需氧菌总数不超过103CFU·g-1，霉菌和酵母菌总数不超过102CFU·g-1，对控制菌未做统一规定[23]。经不同吸收剂量电子束辐照处理山银花药材的生物负载情况见表2，可以看出，未辐照(0 kGy)山银花及其提取物中需氧菌总数分别为9.7×103CFU·g-1和5.6×104CFU·g-1，霉菌和酵母菌总数分别为6.3×103CFU·g-1和3.3×103CFU·g-1。电子束辐照对山银花及其提取物中微生物具有明显的杀灭作用，随着吸收剂量增大，其存活数减少。6.3 kGy吸收剂量电子束辐照后，2种样品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均符合《中华人民共和国药典》规定的微生物限度标准。吸收剂量达到9.5 kGy时，其微生物指标均降至10 CFU·g-1以下。由此可见，电子束辐照技术是一种有效降低山银花中生物负载的方法。

表2 不同吸收剂量电子束辐照山银花药材的生物负载Table 2 The bioburden of Lonicerae flos irradiated by different absorbed doses of electron beam /(CFU·g-1)

2.2 电子束辐照对山银花药材绿原酸含量的影响

绿原酸是山银花的主要活性成分，其含量是衡量山银花质量的重要指标。经不同吸收剂量电子束辐照处理山银花中绿原酸含量的变化如图1所示，山银花样品中绿原酸的含量介于5.34%～5.66%之间，经不同剂量电子束辐照处理山银花样品中绿原酸的含量未发生显著变化，且与未辐照样品相比均无显著差异(P>0.05)；山银花提取物样品中绿原酸的含量介于5.80%～6.28%之间，与未辐照样品相比，2.8、6.3、9.5 kGy吸收剂量电子束辐照处理样品中绿原酸的含量差异达到显著水平(P<0.05)，但变化幅度不大，其变化率分别为1.79、4.89和1.79个百分点；当吸收剂量为18.8 kGy时，其差异不显著(P>0.05)。以山银花及其提取物的绿原酸含量(y)对吸收剂量(x)做一元线性回归分析，分别得到回归方程y=-0.004 6x+ 5.570 4,R2=0.417 1(P=0.24)和y=0.000 8x+ 6.119 8,R2=0.001 3(P=0.96)，显示山银花中绿原酸含量的变化与吸收剂量无明显的线性相关性(P>0.05)。可见，电子束辐照对山银花中绿原酸含量影响不大，吸收剂量达到18.8 kGy时，其含量与未辐照样品相比无显著差异(P>0.05)。

注：不同小写字母表示不同剂量电子束辐照样品间差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters represent significant differences between samples under the conditions of different electron beam irradiation dose at 0.05 level. The same as following.图1 不同吸收剂量电子束辐照处理山银花药材绿原酸含量Fig.1 Chlorogenic acid content of Lonicerae flos irradiated with different absorbed doses of electron beam

2.3 电子束辐照对山银花药材DPPH·清除率的影响

经不同吸收剂量电子束辐照处理后，山银花及其提取物DPPH·清除率的变化情况如图2所示。与未辐照样品相比，不同剂量电子束辐照山银花样品的DPPH·清除率显著增加，但总体变化率较小，介于0.77～1.48个百分点之间。不同剂量电子束辐照处理山银花提取物样品的DPPH·清除率无明显的变化规律。与未辐照样品相比，6.3 kGy吸收剂量电子束辐照样品的DPPH·清除率显著降低(P<0.05)，变化率为11.26个百分点，与之相应绿原酸含量也显著低于对照样品，究其原因，可能与山银花提取物样品本身的一致性有关，但也说明山银花中绿原酸含量与其抗氧化活性密切相关；9.5 kGy时则显著升高(P<0.05)，变化率为3.86个百分点；吸收剂量为18.8 kGy时，样品的DPPH·清除率与未辐照样品无显著差异(P>0.05)。以山银花及其提取物DPPH·清除率(y)对吸收剂量(x)做一元线性回归分析，分别得到回归方程y=-0.062 2x+ 89.014 0,R2=0.766 7(P=0.05)和y=0.129 3x+ 93.073 0,R2=0.029 7(P=0.78)，显示山银花的DPPH·清除率变化与吸收剂量无明显的线性相关性(P>0.05)。可见，电子束辐照对山银花药材DPPH·清除率的影响不大，吸收剂量达到18.8 kGy时，山银花的DPPH·清除率与未辐照样品无显著差异(P>0.05)。

图2 不同吸收剂量电子束辐照处理山银花药材的DPPH·清除率Fig.2 DPPH· scavenging ratio of Lonicerae flos irradiated with different absorbed doses of electron beam

2.4 电子束辐照对山银花药材指纹图谱的影响

未辐照(0 kGy)山银花及其提取物、绿原酸、木犀草苷与芦丁对照品的HPLC图见图3。不同吸收剂量电子束辐照处理山银花及其提取物的HPLC图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版》软件进行处理，以未辐照(0 kGy)山银花及其提取物样品作为参照图谱，利用中位数法进行多点校正、自动匹配(时间窗宽度为0.10)，共标定了22和24个共有峰分别作为山银花及其提取物指纹图谱的特征峰，生成对照图谱R1、R2，即共有模式图，分别见图4和图5，其中，对照图谱R1中9号峰和R2中10号峰为绿原酸。

注：S0：溶剂空白；S1：绿原酸对照品；S2：芦丁对照品；S3：木犀草苷对照品；S4：未辐照山银花(0 kGy)；S5：未辐照山银花提取物(0 kGy)。Note: S0: Blank solvent. S1: Reference substance of chlorogenic acid. S2: Reference substance of rutin. S3: Reference substance of cynaroside. S4: Unirradiated Lonicerae flos. S5: Unirradiated Lonicerae flos extact.图3 对照品与山银花药材的HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of reference substances and Lonicerae flos

注：R1：山银花对照图谱；S1～S3：未辐照样品(0 kGy)；S4～S6：2.8 kGy辐照样品；S7～S9：6.3 kGy辐照样品；S10～S12：9.5 kGy辐照样品；S13～S15：18.8 kGy辐照样品。Note: R1: Reference spectrum of Lonicerae flos. S1～S3: Unirradiated sample. S4～S6: Sample irradiated with 2.8 kGy. S7～S9: Sample irradiated with 6.3 kGy. S10～S12: Sample irradiated with 9.5 kGy. S13～S15: Sample irradiated with 18.8 kGy.图4 山银花的HPLC指纹图谱及其对照指纹图谱Fig.4 HPLC fingerprint chromatograms and reference of Lonicerae flos

注：R2：山银花提取物对照图谱；S1～S3：未辐照样品(0 kGy)；S4～S6∶2.8 kGy辐照样品；S7～S9∶6.3 kGy辐照样品；S10～S12∶9.5 kGy辐照样品；S13～S15：18.8 kGy辐照样品。Note: R2: Reference spectrum of Lonicerae flos extact. S1～S3: Unirradiated sample. S4～S6: Sample irradiated with 2.8 kGy. S7～S9: Sample irradiated with 6.3 kGy. S10～S12: Sample irradiated with 9.5 kGy. S13～S15: Sample irradiated with 18.8 kGy.图5 山银花提取物的HPLC指纹图谱及其对照指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprint chromatograms and reference of Lonicerae flos extract

将经不同吸收剂量电子束辐照处理山银花及其提取物的指纹图谱与对照图谱进行比较，分别计算不同处理山银花及其提取物样品与对照指纹图谱的相似度，结果见表3和表4。由相似度评价结果可以看出，不同剂量电子束辐照处理山银花及其提取物图谱与其对照图谱R1、R2的相似度均为1.0。以9、10号峰绿原酸为参比峰，以其保留时间为1，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。其中，山银花指纹图谱相对保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)小于0.21%，相对峰面积的RSD范围为0.65%～41.41%；山银花提取物指纹图谱相对保留时间的RSD小于3.09%，相对峰面积的RSD范围为0.19%～48.93%。可见，不同吸收剂量电子束辐照处理山银花及其提取物的图谱整体相貌相同，化学组成一致性较好，质量稳定。

表3 不同吸收剂量电子束辐照处理山银花的HPLC指纹图谱相似度Table 3 HPLC chromatograms similarity evaluation of Lonicerae flos irradiated by different absorbed doses of electron beam

表4 不同吸收剂量电子束辐照处理山银花提取物的HPLC指纹图谱相似度Table 4 HPLC chromatograms similarity evaluation of Lonicerae flos extract irradiated by different absorbed doses of electron beam

2.5 电子束辐照山银花药材HPLC指纹图谱的聚类分析

聚类分析(CA)是一种静态数据分析的统计学方法，能够把相似的对象通过静态分类方式分成不同的组别或者更多的子集，让在同一个子集中的对象都有一些相似的属性，目前已广泛应用于模式识别和图像分析等领域[25]。本研究将不同吸收剂量电子束辐照处理的山银花及其提取物样品指纹图谱的共有峰峰面积进行归一化处理，采用MATLAB软件对其进行聚类分析，结果分别见图6和图7。可以看出，山银花及其提取物样品并未随不同吸收剂量呈现各自分组，且纵坐标欧氏距离相差较小，表明不同吸收剂量电子束辐照处理的山银花及其提取物与未辐照样品未呈现明显区分。可见，18.8 kGy以内吸收剂量电子束辐照不会使山银花药材指纹图谱出现显著差异。

图6 不同吸收剂量电子束辐照处理山银花指纹图谱的聚类分析Fig.6 Cluster analysis of HPLC fingerprint chromatogram of Lonicerae flos irradiated with different absorbed doses of electron beam

图7 不同吸收剂量电子束辐照处理山银花提取物指纹图谱的聚类分析Fig.7 Cluster analysis of HPLC fingerprint chromatogram of Lonicerae flos extract irradiated with different absorbed doses of electron beam

3 讨论

中药材贮藏养护是保障中药材质量的重要环节，不同加工方法对山银花中化学成分影响很大[26-27]。硫磺熏蒸曾作为一种传统的中药材养护方法在中药材及饮片加工贮藏中广泛使用，但由于存在二氧化硫残留、有效成分含量明显降低等安全性问题，自2005年版《中华人民共和国药典》起不再收载硫磺熏蒸方法[28]。辐照灭菌是目前中药灭菌常用的方法之一，我国在“六五”、“七五”、“八五”期间对60Co辐照中药灭菌剂量标准开展了大量、系统、深入的研究工作。1997年，卫生部发布了“60Co辐射中药灭菌剂量标准”(内部试行)文件，金银花被列为允许辐照的中药材品种之一[29]。2015年，国家食品药品监督管理总局发布了《中药辐照灭菌技术指导原则》，以指导规范合理地使用中药辐照灭菌技术[30]。但电子束辐照技术应用于传统中药灭菌的历史较短，基础研究较少，需不断完善以满足其应用需求。本研究结果表明，电子束辐照对山银花药材中污染微生物具有明显的杀灭作用，吸收剂量越大，生物负载越低。经6.3 kGy吸收剂量电子束辐照样品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均符合《中华人民共和国药典》规定的微生物限度标准，吸收剂量为9.5 kGy时，样品的微生物总数均低于10 CFU·g-1。 符国栋[31]、蔡汶莉[32]研究电子束辐照山银花药材的贮藏效果，结果表明电子束辐照对山银花中微生物具有明显的杀灭和抑制作用，这与本研究中电子束辐照灭菌山银花及其提取物的结果相似。综上，采用10 kGy以内吸收剂量的电子束辐照可有效控制山银花药材的生物负载，从而达到相关规定的要求。

中药辐照灭菌的效果取决于辐照剂量、微生物菌相、中药剂型等因素，辐照剂量越大，灭菌效果越好，但剂量过大对中药的影响也可能越大[33]。目前对于山银花药材的质量控制，2020年版《中华人民共和国药典》仅规定其性状、鉴别以及指标成分绿原酸含量等[3]。本研究以0～18.8 kGy吸收剂量的电子束辐照山银花及其提取物，结果表明电子束辐照对其指标成分绿原酸含量的影响不大，这与符国栋[31]、蔡汶莉[32]的研究结论一致。但中药成分复杂，主要以多种成分协同发挥疗效，简单用单一成分含量高低评价中药质量存在局限性。中药指纹图谱因其整体性、宏观性和模糊性的特点，已成为中药质量控制的常用方法。目前，山银花药材指纹图谱研究已有相关报道[34-36]，有关60Co-γ射线辐照灭菌中药的指纹图谱研究可见于连翘[37]、姜黄[38]以及六味安消散[39]等，而电子束辐照灭菌中药的指纹图谱研究尚鲜见。本研究利用指纹图谱分析电子束辐照山银花及其提取物，结果表明电子束辐照前后样品指纹图谱未出现显著差异。指纹图谱在一定程度上可对中药质量进行控制，但只能对其中的化学成分进行稳定性分析，并不能解释其与中药药效的相关性，要建立严格的中药质量控制标准，还应关注其与疗效的相关性[24, 40-41]。因此，本研究进一步以DPPH·清除能力评价电子束辐照对山银花及其提取物抗氧化活性的影响，结果表明不超过18.8 kGy电子束辐照对样品的抗氧化活性影响不大。本课题组前期利用抗氧化活性结合指纹图谱评价辐照葛根提取物的质量稳定性，具有一定的参考价值[42]。本研究中利用谱效分析较为全面地评价了电子束辐照灭菌对山银花药材质量的影响。综合评价结果表明，电子束辐照技术是一种能有效降低山银花药材中生物负载的方法，且对其质量的影响不大，可在满足其微生物限度标准的前提下，按照《中药辐照灭菌技术指导原则》的要求尽可能采用不超过10 kGy的低剂量进行辐照[30]。

4 结论

本研究分析了不同吸收剂量电子束辐照处理对中药材山银花及其提取物的生物负载、绿原酸含量、DPPH·清除率及HPLC指纹图谱的影响。结果表明，电子束辐照能够有效降低山银花药材的生物负载，18.8 kGy以内吸收剂量电子束辐照对其主要功效成分及抗氧化活性影响不大，不同剂量辐照处理样品的指纹图谱相似度为1，聚类分析(CA)结果也表明不同样品间未呈现显著差异。综上，电子束辐照是一种控制山银花药材中生物负载的有效方法，且对其化学成分一致性及药材质量稳定性无明显影响。