常温常压等离子体诱变选育高产L-异亮氨酸大肠杆菌

李晓芳 刘慧燕 潘琳 艾治宇 李一鸣 张恒 方海田

（宁夏大学食品与葡萄酒学院 宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，银川 750021）

L-异亮氨酸是支链氨基酸之一，也是人体必需氨基酸，在食品、医药、化工和饲料领域有广泛应用，而且它的需求量逐年增加［1］。目前L-异亮氨酸的生产方法主要是发酵法，增加L-异亮氨酸产量的方法主要通过代谢途径进行精准调节，Shi 等［2］通过过表达ppc和lysC来增加L-异亮氨酸的前体物质产量从而提高L-异亮氨酸产量；Dong等［3］通过敲除ddh和 lysE解除苏氨酸和L-异亮氨酸的反馈抑制来提高L-异亮氨酸的产量；还有研究通过控制当量生物素、分析代谢流上的关键酶及分子能量作用，来进一步提高L-异亮氨酸产量［4-6］。目前国内L-异亮氨酸的生产效率并不能满足当前我国日益增长的需求，与日本等国家还有很大的差距，因此选育高产量的L-异亮氨酸生产菌是当前亟待解决的问题［7］。

常温常压等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变育种技术是一种微生物基因组高效快速诱变育种技术，该技术操作简便、成本低、效率高、突变条件温和，目前已被用于多种微生物的生物育种［8］，Cheng 等［9］利用 ARTP成功选育了高产L-精氨酸菌株；Qiang 等［10］利用ARTP成功选育高产番茄红素菌株；Li 等［11］利用ARTP成功选育高产花生四烯酸菌株；Zhang 等［12］利用ARTP成功选育高产木糖醇酵母菌。传统的微生物培养主要以摇瓶、多孔板、深孔板等容器为主，难于控制实验操作的一致性，目前高通量筛选主要应用在药物上［13］，而食品上应用的高通量筛选仍是传统的多孔筛选［14］。MMC的微液滴培养体系能充分实现实验操作的一致性，精准高效的控制实验过程，是高通量筛选的新技术，目前应用非常少，几乎没有报导。在L-异亮氨酸的合成途径中，苏氨酸脱氢酶是L-异亮氨酸合成途径中的关键酶，异亮氨酸对其有反馈抑制作用［15］，选育α-AB的抗性突变菌，可解除异亮氨酸对苏氨酸脱氢酶的反馈抑制作用，从而提高异亮氨酸的产量［16］，在得到大量突变菌体的基础上，利用MMC实现高通量筛选。

本研究以大肠杆菌K12（Met-）作为出发菌株，采用ARTP诱变技术进行多轮诱变，以异亮氨酸的结构类似物α-AB作为抗性标记，使用MMC进行高通量液滴筛选，进行高通量适应性进化和发酵培养复筛，获得一株高产L-异亮氨酸的诱变大肠杆菌突变菌株，对其遗传稳定性进行验证，并在摇瓶发酵条件下对L-异亮氨酸进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株与试剂 大肠杆菌K12（Met-），宁夏大学食品微生物应用技术与安全控制重点实验室保藏。

无水乙醇、冰乙酸、乙腈、2，4 - 二硝基氟苯（均为分析纯）。

1.1.2 培养基（g/L） （1）LB培养基：蛋白胨10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，琼脂粉 15.0，pH7.0-7.2，121℃ 条件下灭菌15 min。（2）种子培养基：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH7.0-7.2，121℃条件下灭菌15 min。（3）发酵培养基：葡萄糖100.0，磷酸二氢钾3.0，玉米浆20.0，碳酸钙2.0，硫酸铵20.0，硫酸镁 2.5，硫酸亚铁 0.01，pH7.0-7.2，121℃ 条件下灭菌 15 min［17］。

1.1.3 相关溶液配制 L-异亮氨酸标准液、α-AB母液、NaCO3-NaHCO3缓冲液、10%乙酸溶液、苯酚红溶液。

1.1.4 仪器与设备 ARTP常温常压等离子体诱变育种仪、全自动高通量微生物液滴培养仪：无锡源清天木生物科技有限公司；SBA生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；Easysep1010高效液相色谱仪：上海通微分析技术有限公司；AgilentC18（25 mm×4.6 mm，3.5 μm）：安捷伦科技有限公司；WFZ UV-2000紫外分光光度计：尤尼科仪器有限公司；生化恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；恒温摇床：上海福玛实验设备；超净工作台：苏净集团安泰公司；LDZX-40灭菌锅：上海三申。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及培养 将保存在 -80℃ 冰箱的大肠杆菌K12（Met-）划线接种于LB培养基上，37℃倒置培养1 d；挑去平板上的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、200 r/min条件下过夜培养16 h，制成OD600值为0.6-0.8的菌悬液，加入10%甘油，放入超净工作台备用。

1.2.2 菌株ARTP诱变时间的确定 将ARTP的温度保持在20℃，调节功率100 W，氦气流量为10 L/min［18］。吸取10 μL菌悬液均匀涂在金属载片上，将载片用镊子放入诱变室内，采用不同的时间（0 s、30 s、60 s、90 s、150 s、180 s、240 s）对菌液进行诱变处理，诱变后的菌体在1 mL超纯水中充分洗脱1 min后，取100 μL涂布于LB培养基平板上，37℃过夜培养［19］，根据计算的致死率，确定最佳诱变时间。

1.2.3 单因素多水平确定α-AB最高使用浓度 将配制好的1 mol/L的α-AB按要求装入MMC 化学因子进样瓶中，菌液进样瓶装好菌液，培养基进样瓶装好液体LB培养基。按照仪器操作流程进行操作，将化学因子进样瓶中溶液设置8个浓度梯度分别为 0%、9.375%、19.5312%、29.6875%、39.8438%、50%、59.375%、100%，每个浓度梯度设置5个平行，共创建40个液滴。液滴培养24 h后，选择最高适应浓度长得比较好的液滴进行液滴收集，将收集好的液滴用生理盐水稀释至10-2，将其分别涂布于抗性筛选平板上，37℃过夜培养，挑取比较圆而且大的单菌落接至液体培养基中，37℃、200 r/min过夜培养，备用。

1.2.4 突变菌株的适应性进化 将单因素多水平筛选培养好的菌液吸取600 μL于10 mL液体培养基中，装入MMC 菌液进样瓶中，化学因子进样瓶装入1 mol/L的α-AB，培养基进样瓶装好液体LB培养基，按照仪器操作流程进行操作，将化学因子进样瓶中溶液设置8个浓度梯度分别为0%、2.778%、9.735%、16.667%、28.054、48.002%、58%、98.883%，每个浓度梯度3个平行，8 h传一代，共创建48个液滴。液滴培养48 h后，收集在最高浓度梯度长势较好的菌株经稀释后涂布在抗性平板上，37℃过夜培养，挑取比较圆而且大的单菌落接至液体培养基中，37℃、200 r/min过夜培养，备用，并将该收集好的菌株送至上海生工测序。

1.2.5 高产L-异亮氨酸诱变菌株的发酵培养 将原始菌株和筛选得到的高产L-异亮氨酸的诱变菌株分别接于种子培养基中，37℃、200 r/min条件下培养16 h；按10%的接种量接种至发酵培养基中，37℃、200 r/min条件下培养48 h，利用高效液相色谱仪分别测定其L-异亮氨酸的产量。

1.2.6 高产L-异亮氨酸诱变株的遗传稳定性 将诱变后的菌株活化后配制OD600值不超过1.0的菌悬液装入MMC机器的菌液进样瓶中，化学因子进样瓶、培养基进样瓶按照仪器操作要求只装LB液体培养基，将适应性进化页面的化学因子浓度梯度都设为0%，传代时间设为8 h，连续传10代观察其生长状况，分析生长曲线同时收集每一代长势较好的液滴保存进行后续发酵实验。

2 结果

2.1 ARTP最佳诱变时间的确定

致死率的选择直接影响菌株的突变率，本实验设置不同的诱变时间，计算诱变时间对大肠杆菌致死率的影响，实验结果如图1所示。从图1中可以看出，当诱变时间为90 s时，菌株致死率达到86.92%；当诱变时间为150 s时，菌株致死率达到90.65%；当诱变时间为180 s时，菌株致死率达到98.13%；当诱变时间为240 s时，菌株致死率达到100%。因此选择致死率在98%以上的180 s为最佳诱变时间。

图1 大肠杆菌ARTP诱变致死率曲线Fig. 1 Lethality curve of Escherichia coli ARTP mutagenesis

2.2 α-AB最高使用浓度的确定

适应结构类似物浓度的确定可以初步判断该菌株解除反馈抑制的能力。本实验利用MMC对α-AB的使用浓度进行单因素多水平实验，从图2中可以看出，当α-AB的使用浓度在前两个浓度时，所有液滴OD值在0.87左右，说明该浓度下菌体均能正常生长，随着α-AB的使用浓度增大，第3个浓度的大部分OD值在0.46左右，极少数液滴OD值接近0.50，其余液滴OD值在0.40左右；当α-AB的使用浓度在第4个浓度时，只有极个别液滴的OD值达到0.50左右，其余液滴的OD值均为负值，这表明该浓度已经对菌株产生了毒害作用；第5个到第8个浓度，所有液滴的OD值均为负值，这说明该4个浓度条件下，菌株不能生长。因此，由实验结果确定，α-AB的最高使用浓度为第4个浓度29.6875%。

图2 大肠杆菌NXU12单因素多水平曲线Fig. 2 Single-factor multi-level curve of E. coli NXU12

2.3 突变菌株适应性进化结果

研究表明，在菌株可以正常生长的范围内，α-AB使用浓度越高，L-异亮氨酸积累的量就越多，L-异亮氨酸解除自身浓度反馈效果越明显，因此L-异亮氨酸产量会更高。本实验利用诱变后的菌株，在确定其可适应的α-AB最高使用浓度基础上，进一步进行适应性进化，实验结果如图3所示。在α-AB的使用浓度低于第5个浓度时，所有液滴OD值均在0.67左右，长势基本一致，只有2号液滴OD值明显增大接近于0.8；在α-AB的使用浓度接近第6个浓度时，大部分液滴OD值明显减小均在0.12左右，只有2、3号液滴OD值明显增大达到1.35、1.78，这说明2、3号液滴已经适应当前浓度并且长势明显变好；当α-AB的使用浓度大于第6个浓度时，所有液滴的OD值均无变化，说明此浓度对菌体本身产生毒害作用。实验结果表明，该突变菌株经适应性进化后，α-AB的使用浓度为第6个浓度48.002%。

图3 大肠杆菌NXU12适应性进化曲线Fig. 3 Adaptive evolution curve of E. coli NXU12

2.4 菌株测序结果

为验证适应性进化所得到的菌株是否为突变株，将该菌株制成菌悬液送至上海生工进行测序，测序基因为 ilvA，测序结果利用软件分析后如图4所示。图 4 中红色箭头为大肠杆菌 K12，绿色箭头为大肠杆菌 NXU12，测序结果相同性为81.15%，从图中可以看出，大肠杆菌 NXU12 发生了大量基因的突变，这可能是导致该菌株可以适应高浓度α-AB的原因。

图4 大肠杆菌K12、NXU12测序结果Fig. 4 Sequencing results of E. coli K12 and NXU12

2.5 高产L-异亮氨酸菌株NXU12发酵结果

将原始菌株K12、诱变菌株NXU12进行摇瓶发酵培养，采用分批补料的发酵方法，发酵期间保持pH在7.0-7.2之间、期间补充60%的葡萄糖溶液以保证菌体能够正常生长、补充尿素保证碳源充足。连续发酵40 h后，耗糖曲线如图5所示，采用2，4 -二硝基氟苯法进行柱前衍生化处理，利用高效液相色谱仪（HPLC）检测发酵液中L-异亮氨酸的浓度，结果如图6所示。

图5 大肠杆菌K12、NXU12耗糖量曲线Fig. 5 Sugar consumption curve of E. coli K12 and NXU12

从图5可以看出，从发酵开始大肠杆菌NXU12的耗糖量略高于K12；在发酵中期两株菌的耗糖量趋势基本一致，这可能是NXU12发生突变后并没有影响其自身生长；发酵后期K12的耗糖量基本稳定，而NXU12的耗糖量呈微量上升趋势，这可能是因为NXU12突变，在发酵后期菌体仍然可以正常生长，正常消耗糖。

从图6可以看出，NXU12发酵40 h后，L-异亮氨酸的浓度为17.468 2 g/L，比原始菌株提高了61.23%。NXU12在发酵中后期L-异亮氨酸积累量较高，这可能是因为NXU12可以适应高浓度的α-AB，在发酵过程中解除了L-异亮氨酸对苏氨酸脱氢酶的反馈抑制，从而使L-异亮氨酸不断积累浓度提高。

图6 大肠杆菌K12、NXU12 L-异亮氨酸浓度Fig. 6 E. coli K12 and NXU12 L-isoleucine concentration

2.6 大肠杆菌遗传稳定性测定结果

将突变菌株大肠杆菌NXU12连续传10代后，收集长势比较好的液滴进行生长曲线和发酵液中L-异亮氨酸浓度测定。从图7可以看出，传10代后的大肠杆菌NXU12仍能正常生长，从图8可以看出该突变菌株发酵液中L-异亮氨酸浓度稳定，这说明诱变菌株遗传稳定性良好。

图7 大肠杆菌NXU12传10代后生长曲线Fig. 7 Growth curve of E. coli NXU12 after 10 generations

图8 大肠杆菌NXU12传10代L-异亮氨酸浓度Fig. 8 L-isoleucine concentration of E. coli NXU12 for 10 generations

3 讨论

本实验主要通过ARTP结合MMC生物诱变及高通量筛选体系，以α-AB为抗性标记定向选育L-异亮氨酸高产大肠杆菌，最终成功选育出一株可在α-AB浓度为 48.002% 即 49.44 g/L条件下正常生长的突变菌株大肠杆菌NXU12。该菌株摇瓶发酵 40 h后，L-异亮氨酸浓度为17.462 8 g/L，较原始菌株提高了60.23%，此外通过测定了发酵液中L-苏氨酸的浓度发现，L-苏氨酸的浓度明显比原始菌株提高，这说明高浓度的α-AB可激活天冬氨激酶从而解除苏氨酸脱氢酶的反馈抑制增加L-异亮氨酸前体物质苏氨酸的积累量。孔帅等［20］利用ARTP 成功选育高产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌B1，该菌株摇瓶发酵L-异亮氨酸产量达18.5g/L，比原始菌株提高62.03%；Sun等［21］突变了异亮氨酸-tRNA合成酶并构建了基于氨酰基tRNA合成酶全细胞传感器，该传感器可特异性识别产高浓度L-异亮氨酸的细胞从而实现高通量筛选。L-异亮氨酸高产菌株的选育需要从更精准的方向深入研究，精准高效的高通量筛选方式也是选育高产菌株的趋势。

4 结论

通过ARTP结合MMC筛选出一株可适应高浓度α-AB的抗性突变菌株NXU12，经发酵测得该菌株产L-异亮氨酸浓度提高了1.61倍，经基因测序分析发现ilvA部分碱基发生突变，但遗传稳定性良好，可作为L-异亮氨酸生产备用菌株或构建L-异亮氨酸高产菌株的底盘菌株。等离子诱变结合高通量筛选不仅提高了筛选高产菌株的效率，而且为筛选其他抗性菌株、高产氨基酸菌株提供重要参考。