Per1基因对口腔鳞癌细胞增殖侵袭和迁移的影响

许 刚, 宋其义, 於丽乔

(1. 盘锦辽油宝石花医院口腔科, 辽宁 盘锦 124010 2.大连医科大学口腔医学院附属口腔医院口腔科, 辽宁 大连 116023)

口腔鳞状细胞癌是指发生在口腔,包括舌、牙龈、颊、腭、口底等部位的一种癌症疾病[1]。口腔的鳞状上皮癌除了局部增生,侵蚀周围组织造成功能障碍以外,还经常会发生相应的颈部的淋巴引流区的淋巴结转移。因此,口腔鳞癌治疗的时候除了局部原发病灶的扩大切除以外,通常还需要切除颈部的整块淋巴组织,也就是所谓的颈淋巴结清扫[2]。Per1基因,即period1基因,是生物节律分子振荡系统的重要组成部分,属于Period基因家族的主要组成成员,在人体的各类组织及器官中均有表达。有研究表明,Per1在口腔鳞癌细胞的发生发展中发挥了重要的生物学作用[3,4]。本实验主要探讨Per1基因通过调控Wnt/β-catenin信号通路对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1试剂:人口腔鳞癌细胞系SCC-15、SCC-4、Cal-27和人正常口腔上皮细胞系HOK购于中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养基、FBS、青链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶购于美国Hyclone公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；MTT试剂购于美国Sigma公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于大连Takara公司；Transwell实验材料购于上海煊翎生物科技有限公司；BCA试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.2组织来源:选取2018年8月到2019年10月到我院进行手术的50例口腔鳞癌患者,在手术中切除口腔鳞癌组织及其癌旁组织。

1.2细胞培养、转染和分组:在含10% FBS、100 U/mL青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中培养细胞,培养箱温度为37℃、体积分数为5% CO2,待细胞融合度达90%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化传代。采用脂质体转染法,依据Lipofectamine2000的试剂盒说明书将si-Per1和si-NC分别转染至SCC-15细胞,作为si-Per1组和si-NC组。各组SCC-15细胞转染48h后,进行后续实验。

1.3RT-qPCR检测Per1基因表达水平:Trizol试剂提取各组细胞总RNA,逆转录试剂盒合成cDNA,利用SYBR Premix Ex TaqⅡ在进行RT-qPCR反应。Per1上游引物：5'-CTGCTACAGGCACGTTCAAG-3',下游引物：5'-CTCAGGGACCAAGGCTAGTG-3'；β-actin上游引物5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3',下游引物5'-CAGCGG AACCGCTCATTGCCAATGG-3'。采用2-ΔΔCt公式计算Per1基因表达水平。

1.4MTT检测细胞增殖:在96孔板中接种各组细胞,每孔中再添加100μL MTT试剂,37℃培养4h后,再添加150μL DMSO,摇床振荡10min,待结晶物全部溶解后,使用波长为450nm的酶标仪测定处细胞OD值。

1.5Transwell检测细胞侵袭和迁移:调整各组细胞浓度为5×104个/mL,迁移实验：Transwell小室置于24孔板中,上室加100μL细胞悬液,下室中加入500μL含10% FBS的细胞培养基作为诱导剂。24h后吸去培养液,PBS洗涤小室,用棉签轻轻擦去上层细胞,4%多聚甲醛固定30min,0.4%结晶紫染色15min,倒置显微镜观察,随机选取5个视野计数。侵袭实验：Matrigel基质胶4℃融化后,铺于Transwell上室,凝固后接种细胞,之后同细胞迁移操作。

1.6Western blot检测蛋白表达:RIPA试剂提取细胞中总蛋白,BCA法对蛋白定量。定量蛋白后,采用10% SDS-PAGE电泳分离等量的蛋白,并利用湿法转膜仪转移至PVDF膜。用含5%脱脂牛奶缓冲液封闭膜后,将膜与一抗溶液(Ki-67、CyclinD1、MMP-2、MMP-9为1∶1000稀释,β-catenin为1∶500稀释),4℃下孵育12h。随后用稀释的二抗(1∶2000)孵育2h。用增强的化学发光试剂盒检测蛋白印迹,以β-actin为内参,Image J软件分析目的蛋白表达。

2 结 果

2.1Per1基因在各组细胞中的表达水平:与HOK组比较,Cal-27、SCC-4、SCC-15中Per1基因表达水平显著降低(P<0.05)。SCC-15中Per1基因表达水平最低,因此选择SCC-15细胞用于后续实验。见表1。

表1 Per1基因在各组细胞中的表达水平

2.2Per1基因在口腔鳞癌组织及其癌旁组织中的表达水平:与癌旁组织比较,口腔鳞癌组织中Per1基因表达水平显著降低(P<0.05)。见表2。

2.3抑制Per1基因表达对口腔鳞癌细胞增殖的影响:与si-NC组比较,si-Per1组OD值显著升高(P<0.05),Ki-67、CyclinD1蛋白表达显著升高(P<0.05),见图1,表3。

2.4抑制Per1基因表达对口腔鳞癌细胞侵袭和迁移的影响:与si-NC组比较,si-Per1组侵袭、迁移细胞数显著升高(P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图2,表4。

表2 Per1基因在口腔鳞癌组织及其癌旁组织中的表达水平

表3 抑制Per1基因表达对口腔鳞癌细胞增殖的影响

表4 抑制Per1基因表达对口腔鳞癌细胞侵袭和迁移的影响

2.5Wnt/β-catenin信号通路:与si-NC组比较,si-Per1组β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图3,表5。

图1 相关蛋白表达

图2 相关蛋白表达

图3 相关蛋白表达

表5 Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达

3 讨 论

鳞状细胞癌简称鳞癌,又被称为表皮癌,属于一种恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康和生命安全。因为口腔黏膜被覆的就是鳞状上皮,这些部位发生的癌变称为鳞状上皮癌,发生于口部的鳞癌又称为口腔鳞癌[5,6]。本实验研究发现,与正常口腔上皮细胞HOK组比较,Cal-27、SCC-4、SCC-15细胞中Per1基因表达水平显著降低。与癌旁组织比较,口腔鳞癌组织中Per1基因表达水平显著降低。抑制Per1表达后,细胞OD值显著升高,Ki-67、CyclinD1蛋白表达显著升高。抑制Per1表达后,口腔鳞癌侵袭、迁移细胞数显著升高,MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高。已经有类似的研究结果与本实验一样。赵宁波[7]研究发现,Per1基因在口腔鳞癌中的表达水平显著降低。Qin等[8]研究发现,Per1敲低后,SCC-15细胞的增殖指数显着增加,而凋亡指数则显着下降。Yang等[9]研究发现,时钟基因Per1通过AKT/mTOR途径促进口腔鳞状细胞癌的进展。Li等[10]研究发现,Per1的异常表达可影响肿瘤细胞的增殖,细胞凋亡,迁移和侵袭。

Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络,其功能最常见于胚胎发育和癌症。当Wnt信号失活,导致β-catenin降解,β-catenin迁移到细胞核并与TCF/LEF转录位点结合,刺激Wnt靶基因的转录,从而影响肿瘤细胞的发生[11]。本实验研究表明,抑制Per1表达后,细胞中β-catenin蛋白表达显著降低。本实验结果与他人文献报道一致。陈顺金等[12]研究表明,Wnt/β-catenin信号通路在口腔鳞癌干细胞的迁移、侵袭及EMT转化中发挥重要作用,对于肿瘤的治疗有显著的指导意义。刘红文等[13]研究表明,上调lncRNA CASC2C表达可逆转口腔鳞癌的耐药性,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。范龙坤等[14]研究表明,抑制Wnt/β-catenin信号通路能够明显减弱肿瘤干细胞的迁移及侵袭能力。

综上所述,干扰Per1基因可抑制口腔鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移,这可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关,本实验的研究结论为该疾病的治疗提供了理论依据,在临床中具有非常重要的意义。