复方茶油涂鼻膏对鼻腔致敏小鼠治疗作用的研究*

段佳丽，杨 娜，金日群，徐仙赟，邓太海，廖志王莹，王英斌，刘 芳，彭韶平

(1.赣南医学院，江西 赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，江西 赣州 341000)

变应性鼻炎(AR)是由IgE介导的上呼吸道慢性炎症性疾病，目前已成为一种全球性健康问题。AR不仅会对患者睡眠、认知功能、情绪等造成不良影响，影响工作、学习和日常生活水平[1]，而且还会增加哮喘、结膜炎、鼻窦炎、中耳炎等疾病的患病风险。流行病学研究显示，在过去数十年中，发达国家和发展中国家的AR患病率均明显升高，目前全球患病率为10.0%～40.0%，我国为8.0%～24.1%[2-3]。

在AR的治疗方面，除了常见的环境控制、西药、免疫、手术等方法以外，中医药也具有较好疗效，而对中药及其相关产品的研究也越来越多。临床研究发现，复方茶油涂鼻膏联合曲安奈德鼻喷雾剂治疗，可以有效改善AR患者症状[4]，但其作用机制尚不明确。在AR发病机制的研究中，Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)/Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)免疫应答失衡被认为是AR发生、发展的主要机制[5]。本研究通过观察复方茶油涂鼻膏对卵清蛋白(OVA)鼻腔致敏小鼠的行为学评分、鼻黏膜组织形态学的影响，评价其治疗效果；通过检测鼻腔灌洗液中Th1分泌的相关细胞因子[白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)]和Th2分泌的相关细胞因子(IL-4、IL-5)水平，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 选取雄性BALB/c小鼠48只作为研究对象，小鼠为清洁级，6～8周龄，体重16～20 g，购于赣南医学院实验动物中心[使用许可证SYXK(赣)2018-0004]。随机将48只小鼠分为6组(空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、低剂量药物组、中剂量药物组和高剂量药物组)，每组8只。适应性喂养5 d后开始相关实验。本研究遵照国家和赣南医学院动物关爱与使用委员会相关规定进行。

1.2方法

1.2.1主要药物和试剂 复方茶油涂鼻膏：主要成分包括茶油、黄芩和苍耳子，由赣南医学院药学院制备。其中，中剂量为临床所使用的复方茶油涂鼻膏，高、低剂量为上述3种主要成分各增、减1倍后所制备的涂鼻膏。曲安奈德鼻喷雾剂：昆明源瑞制药有限公司生产，国药准字H20051175。鸡卵清蛋白购于美国Sigma公司。氢氧化铝粉末购于国药化学试剂公司。乙二胺四乙酸二钠购于北京Solarbio公司。小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购于武汉博士德公司。苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购于北京Solarbio公司。

1.2.2主要仪器 微量移液器(美国Thermo公司生产)，智能型生物组织包埋机(浙江益迪医疗设备厂生产)，手动轮转切片机(德国LEICA公司生产)，多功能酶标仪(美国Thermo公司生产)。

1.2.3模型建立 分为基础致敏和鼻部激发2个阶段建立小鼠AR模型。(1)在第1、8、15天，分别予以包含50 μg OVA和2 mg佐剂氢氧化铝粉末的生理盐水悬浊液200 μL行腹腔注射基础致敏，共3次；(2)间隔1周后，从第22天起用5% OVA生理盐水溶液滴鼻，行鼻部激发1周，每天1次，每次各鼻腔10 μL。空白对照组的腹腔基础致敏和鼻部激发都采用生理盐水替代进行。

1.2.4鼻腔给药 从第29天开始，连续鼻腔给药2周，每天1次。低、中、高剂量药物组分别予以等量的低、中、高剂量复方茶油涂鼻膏涂抹鼻腔。阴性对照组予以等量凡士林涂鼻。阳性对照组采用曲安奈德滴鼻，按照成人剂量换算后，每侧鼻腔0.6 μL。鼻腔给药2周时间里，每隔1 d，在给药后1 h，予以1.2.3中等量的5% OVA生理盐水溶液滴鼻，维持鼻部激发。空白对照组以生理盐水替代进行。

1.2.5行为学评分 分别于末次鼻部激发(第28天)和末次鼻腔给药(第42天)，采用双盲，由不参与本实验的其他人员对各小鼠的行为表现进行观察和记录，时间为5 min，评定模型的建立情况和药物疗效情况。参照行为学评定标准(表1)，以总分大于5分表示建模成功[6]。

表1 小鼠行为学评定标准

1.2.6标本的采集 在最后1次鼻腔给药24 h后处死小鼠取材。(1)取鼻腔灌洗液，静置、离心、分装后，以-80 ℃保存，用于后续实验。(2)取整个小鼠鼻部，清洗、固定、脱钙后，用于后续实验。

1.2.7鼻黏膜组织形态学观察 小鼠鼻部脱钙结束后，适当修剪处理、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片，行HE染色。观察小鼠鼻黏膜的上皮是否完整，基底细胞是否正常，黏膜下是否有血管扩张和腺体增生，是否有以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润等AR表现。

1.2.8Th1/Th2相关细胞因子的检测 严格参照试剂盒相关说明，检测鼻腔灌洗液中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ的表达水平。

2 结 果

2.1各组行为学评分比较 造模结束后，阴性对照组、阳性对照组、低剂量药物组、中剂量药物组和高剂量药物组的小鼠行为学评分均高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，表示造模成功。鼻腔给药后，阴性对照组小鼠的行为学评分(7.63±0.52)分明显高于空白对照组的(3.13±0.64)分，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与低剂量药物组行为学评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)；中剂量药物组和高剂量药物组行为学评分明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；中剂量药物组和高剂量药物组行为学评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组行为学评分比较分)

2.2鼻黏膜组织形态学 病理切片HE染色显微镜下观察，空白对照组小鼠鼻黏膜的上皮完整，基底细胞正常，黏膜下无血管扩张和腺体增生，无明显炎性细胞浸润。阴性对照组小鼠鼻黏膜增生，上皮细胞结构破坏，黏膜下血管扩张、腺体增生，有大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主。低剂量药物组小鼠鼻黏膜增生，黏膜下血管扩张、腺体增生，并可见大量炎症细胞浸润，同样以嗜酸性粒细胞为主。阳性对照组、中剂量药物组和高剂量药物组的镜下表现基本相同，其上皮细胞结构基本完整，排列整齐，黏膜下可见少许血管扩张、腺体增生，可见少许炎性细胞浸润，但无嗜酸性粒细胞浸润。见图1。

A为空白对照组；B为阴性对照组；C为阳性对照组；D为低剂量药物组；E为中剂量药物组；F为高剂量药物组。

2.3各组鼻腔灌洗液中IL-2、IFN-γ水平比较 给药后，阴性对照组小鼠鼻腔灌洗液中IL-2、IFN-γ水平明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。低剂量药物组IL-2、IFN-γ水平与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。中剂量药物组和高剂量药物组IL-2、IFN-γ水平均明显高于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。中剂量药物组和高剂量药物组IL-2、IFN-γ水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组鼻腔灌洗液中IL-2、IFN-γ水平比较

2.4各组鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5水平比较 给药后，阴性对照组小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。低剂量药物组IL-4、IL-5水平与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。中剂量药物组和高剂量药物组IL-4、IL-5水平均明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。中剂量药物组和高剂量药物组IL-4、IL-5水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5水平比较

3 讨 论

AR是最常见的上呼吸道疾病之一，患病率正逐年升高。环境控制、西药、免疫、手术等方案虽然对AR均有一定疗效，但都存在限制。例如，变应原多样，生活中难以完全避免；免疫治疗目前仅限尘螨且时间长，患者难以坚持[4]。研究表明，中药在治疗AR上也具有较好效果，能够改善鼻部症状和降低复发率[7]，中医、中西医结合治疗AR在我国非常普遍。祖国医学对AR的研究历史悠久，中医上将其归于“鼻鼽”范畴，相关记载最早可追溯于《礼记》(《月令》篇)[3]。

AR的发病机制复杂，现代中医认为，AR是由原发病因、继发病因和诱发因素3个方面共同作用而引起[8]。西医认为，AR主要受环境因素、遗传因素、Th1/Th2平衡失调、神经调节、炎症细胞因子等影响[9]，其中最为公认的机制是Th1/Th2平衡失调。该机制为AR引起Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ等)减少，而Th2型细胞因子(IL-4、IL-5等)增多。

复方茶油涂鼻膏主要成分为茶油、黄芩和苍耳子，给药方式为鼻黏膜给药，不仅方便，而且鼻黏膜无角质层且毛细血管丰富，经黏膜给药所需剂量少、生物利用度高、起效快[4]。茶油是从油茶种子中所榨取的一种油类，其作为我国特有的一种植物，已有2 000多年栽培历史，主要分布于我国南方，特别是江西省赣南地区。茶油的主要成分包括不饱和脂肪酸、茶多酚、角鲨烯、皂甙、胡萝卜素和维生素等[10]。在我国民间，茶油常被用于治疗胃肠疼痛和皮肤烧伤。科学研究表明，茶油及其主要成分可能具有更广泛的功能，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、预防心血管疾病、降血压和降血糖等[10]。目前，茶油不仅已被作为药用油收载于《中国中医药大辞典》，还成为国家大力推广使用的一种纯天然植物油[11-12]。另一主要成分黄芩是一种具有多种药用价值的草药，在中国、日本、韩国等东方国家常被用于治疗炎症、过敏、细菌和病毒感染等疾病[13]。

有研究证实，黄芩及其提取物黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等具有抗氧化、抗炎和抗过敏等多种生物活性作用[13-17]。黄芩苷不仅能抑制IgE、IL-4、IL-6等的释放，还可以调节花生四烯酸代谢、柠檬酸循环、组氨酸代谢及其他氨基酸的代谢活动，发挥抗AR的作用[18]。哮喘与AR有“同一气道，同一疾病”之称，在哮喘的相关研究中也发现，黄芩素能够降低气道损伤，包括气道高反应性、气道炎症和气道上皮细胞的凋亡等，恢复线粒体功能，减轻和治疗哮喘[16]。黄芩苷不仅能调节Th17/Treg反应失衡，有效预防小鼠OVA+LPS诱导的哮喘[19]，还可以抑制核因子κB(NF-κB)和趋化因子受体7(CCR7)/CCL19/CCL21的表达，减轻OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症[20]。另外，黄芩苷还能抑制哮喘小鼠IL-4的表达，促进IFN-γ表达，抑制嗜酸性粒细胞的聚集和气道黏液的过量产生，改善气道高反应性[21]。苍耳子是一种非常普遍的传统中药，常被用于治疗鼻窦炎、风湿性头痛和皮肤瘙痒等[22]。研究发现，其不仅可以稳定肥大细胞的细胞膜，减少其脱颗粒作用，抑制肥大细胞介导的过敏反应[23]，还具有抗肿瘤、抗炎和镇痛、抗寄生虫、抗氧化、抗菌、抗真菌、抗病毒等作用[22,24]。在AR方面，苍耳子是中药方剂中治疗AR的常见成分之一，均作为君药或臣药使用[25]。研究发现，苍耳子对于改善AR的临床症状具有较好疗效[25-26]。

本研究使用复方茶油涂鼻膏治疗OVA致敏的小鼠，观察其疗效并探讨可能的作用机制。结果显示，鼻腔给药后，中剂量药物组和高剂量药物组行为学评分明显低于阴性对照组，且鼻黏膜的组织形态学表现明显改善，表明中、高剂量复方茶油涂鼻膏对治疗致敏小鼠有效。鼻腔给药后，与阴性对照组小鼠比较，中剂量药物组和高剂量药物组鼻腔灌洗液中IL-2、IFN-γ水平明显升高，IL-4、IL-5水平明显下降，进一步说明中、高剂量复方茶油涂鼻膏对治疗鼻腔致敏小鼠有效，其作用机制可能是通过纠正致敏小鼠的Th1/Th2失衡，从而引起Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)水平升高，Th2型细胞因子(IL-4、IL-5)水平降低。低剂量药物组给药后的行为学评分、鼻黏膜组织形态学表现，以及鼻腔灌洗液中IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ水平均与阴性对照组无明显差异，表明低剂量药物对过敏的治疗效果较差，使用时需加大剂量。中、高剂量药物组间的行为学评分、鼻黏膜组织形态学表现，以及鼻腔灌洗液中IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ水平比较也无明显差异，表明当达到药效剂量时，并不需要继续提高剂量。

综上所述，中、高剂量复方茶油涂鼻膏对鼻腔致敏小鼠的治疗有效，其作用机制可能是纠正Th1/Th2失衡，这与有关临床研究结果相呼应[4]，提示复方茶油涂鼻膏对于临床AR患者也具有良好的治疗效果。但AR的发病机制复杂，本研究只探讨了复方茶油涂鼻膏对鼻腔致敏小鼠的治疗作用及可能机制，还需要进一步的深入研究来更全面地了解复方茶油涂鼻膏对AR的作用机制。