火炭母抑制人宫颈癌SiHa细胞增殖的效果研究*

陈爱娟，蒋春波，陈 伟，胡 芳

(南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 215009)

宫颈癌是当前第二常见的女性癌症[1],全球每年有超过53万的新发病例和超过20万的死亡病例[2-3]。近年来,宫颈癌在发展中国家的发病率正在逐年上升，且患者越来越年轻化[4-5]。对于大多数早期宫颈癌患者，普遍可以通过自身免疫、根治性手术及放化疗治愈，而对于预后仍较差的晚期宫颈癌患者，则将化疗方案作为主要治疗手段[6]。许多研究者一直在努力寻找更有效的化疗药物来治疗宫颈癌。

宫颈癌的发病因素较多，其中人乳头瘤病毒(HPV)是主要致病因素之一。研究发现，超过70%的病例均与HPV感染相关[7-10]。细胞凋亡是一种由基因网络控制的细胞自杀形式，也是包括癌症在内诸多疾病发病机制中必不可少的过程和关键因素。通过药物促进细胞凋亡来抑制恶性细胞增殖是一种有效的治疗手段[11-14]。然而，许多临床抗癌药物所引发的不良反应和耐药性难以解决。因此，需要寻找并开发更加安全、有效的抗癌药物来治疗宫颈癌。

火炭母是蓼科植物火炭母的地上部分，主要分布在广东、广西、福建、海南等地，火炭母在华南地区通常作为原材料被用于凉茶制作，但其也是一种传统中药[15-16]。火炭母含有酚酸类、黄酮类等化学成分，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗氧化等[17]。已有的研究表明，植物中的酚酸具有抗肿瘤作用，如四棱草中的有机酸对人肝癌有抑制作用，水悬钩子对人乳腺肿瘤有抑制作用，而桦树皮中的白桦酸则对宫颈上皮肿瘤有抑制作用[18]。

研究发现，火炭母在肝癌和结直肠癌中具有抗肿瘤活性[19]，但少见火炭母抗宫颈肿瘤作用的相关报道。本研究以宫颈上皮鳞状癌SiHa细胞为研究对象，考察火炭母指标性酚酸柯里拉京对SiHa细胞增殖抑制作用及诱导凋亡机制，以期发现具有抗肿瘤活性的新物质。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 火炭母(苏州春晖堂中药饮片有限公司，批号20200926)，柯里拉京(南京金益佰生物科技有限公司，批号20190311)，Cell Counting Kit-8(CCK8，碧云天生物技术有限公司)，SiHa细胞(ATCC细胞库)，磷酸缓冲盐溶液(PBS，美国Giboco公司)，DMEM(美国Giboco公司)，胎牛血清(美国Giboco公司)，青霉素/链霉素双抗(美国Giboco公司)，胰蛋白酶(美国Giboco公司)，细胞凋亡流式试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，P53、Bax、Bcl2、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-9、β-actin(英国Abcam公司)，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、甲酸(美国霍尼韦尔公司)。

1.1.2仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters 公司)，Triple TOFTM5600质谱仪(美国AB 公司),MS105十万分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo)，Milli-Q3超纯水系统(美国 Millipore 公司)，HH-S4数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)，CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)，倒置相差光学显微镜及倒置相差荧光显微镜(日本Olympus公司)，DNM9602A酶标分析仪(美国Molecular Devices公司)，超低温冰箱(青岛海尔公司)，移液枪(Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1火炭母不同溶剂提取物制备 称取火炭母药材，打成粗粉，称取3份，每份 50 g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，分别加入500 mL水、乙醇、氯仿进行提取，均进行回流提取，提取2次，每次1 h。提取完毕后分别合并2次提取液，经真空浓缩后冷冻干燥，分别得到火炭母水提、醇提、氯仿提的干燥提取物，干燥物分别以DMSO溶解，配制成5、10、25、50、100 μg/mL的溶液。

1.2.2柯里拉京溶液制备 称取柯里拉京对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，加入DMSO溶解，配制成1 mg/mL的对照品储备液。以DMSO依次稀释配制成5、10、25、50、100 μg/mL的溶液，备用。

1.2.3细胞培养 从液氮中取出装有宫颈上皮鳞状癌SiHa细胞的冻存管，置于37 ℃的水浴环境中解冻，待细胞融化完全，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min，小心去除上清液，将细胞转移至25T培养瓶中。加入含10%胎牛血清青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的DMEM完全培养液，将细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养，每天在显微镜下观察，发现大部分细胞变圆或间隙增大时弃去原有培养液，更换新的DMEM培养液，待细胞长至80%进行传代培养[20]。

1.2.4CCK8检测SiHa细胞的增殖抑制 取对数生长期细胞，采用0.25%的胰酶消化轻吹单细胞悬浮后计数，以5 000个/孔的细胞浓度接种于96孔板，每孔100 μL，同时设空白孔。过夜待细胞贴壁。在显微镜下对细胞进行观察，发现细胞完全贴壁生长后，小心吸弃培养基，再向每个孔中加入20 μL不同水平的柯里拉京溶液处理SiHa细胞，水平梯度设置为0(DMSO)、10、25、50、75、100 μmol/L,另设空白对照组。每组平行设置5个复孔，置于37 ℃培养箱中分别培养24、48、72 h。随后去除原有培养基，随后每孔加入90 μL完全培养基和10 μL CCK8试剂，37 ℃环境下孵育1 h。使用酶标仪于450 nm处检测吸光度(A值)，实验平行进行3次，计算抑制率。其中，抑制率=(A加药-A空白)/(A0给药-A空白)×100%；A加药为细胞溶液、CCK8溶液和药物溶液的A值；A0给药为有细胞溶液、CCK8溶液，但没有药物溶液孔的A值；A空白为培养基、CCK8溶液、无细胞空白孔的A值。

1.2.5火炭母水提液液质联用色谱分析 对火炭母水提取物进行液质联用色谱分析。取火炭母水提取物干粉，DMSO溶解，经0.25 μm微孔滤膜过滤，调整进样浓度为1 mg/mL。采用0.2%(v/v)甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1，流速为1.0 mL/min，检测波长为365 nm。进样量为2 μL，柱温为30 ℃。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子模式检测；质量扫描范围m/z为50～2 000；喷雾电压为5 500 V；解簇电压为100 V；去簇电压为40 V；裂解电压为20 V；离子源温度为600 ℃；雾化器为60 psi(1 psi=6.895 kPa)；辅助加热器为60 psi；气帘气为40 psi。

表1 梯度洗脱程序

2 结 果

2.1火炭母对SiHa细胞增殖的抑制作用 火炭母水提液对SiHa细胞增殖的抑制作用较强，见图1。

图1 火炭母不同溶剂提取物对SiHa细胞增殖的抑制作用

2.2火炭母水提液液质联用色谱分析 火炭母不同溶剂提取物经液质联用分析发现，三氯甲烷中的提取成分最少；其次为乙醇，乙醇提取物色谱峰与水提成分重叠，且水提液中色谱峰的丰度远高于乙醇提取物。对火炭母的水提液进行液质分析，经数据库与文献检索发现，火炭母水提液中解析出了12种成分，其中主要为酚酸类物质(诃子酸、柠檬酸、没食子酸、绿原酸、短叶苏木酚酸、柯里拉京、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、鞣花酸、二氢杨梅素、槲皮素、Enyssoside、3,3-二甲基鞣花酸)，见图2、表2。

表2 火炭母水提液解析成分表

2.3柯里拉京对SiHa细胞增殖的抑制作用 不同浓度的柯里拉京均对SiHa细胞增殖具有抑制作用(图3)，随着柯里拉京浓度与作用时间的增加，其对SiHa细胞增殖的抑制作用加强，呈量效依赖关系。柯里拉京对SiHa细胞增殖的抑制作用在72 h时最强，24 h的IC50为(42.50±0.38)μmol/L，48 h的IC50为(33.20±0.21)μmol/L，72 h的IC50为(26.30±0.15)μmol/L。因此，可选择48 h作为给药孵育时间并用于后续的凋亡研究。

图3 柯里拉京对SiHa细胞的增殖抑制效应

2.4柯里拉京诱导SiHa细胞凋亡结果 流式细胞实验结果显示，不同浓度的柯里拉京(0、25、50、75 μmol/L)作用于SiHa细胞48 h后，SiHa细胞凋亡率显著增加，75 μmol/L的柯里拉京诱导SiHa细胞凋亡率增加到55.73%，差异有统计学意义(P<0.05)；与柯里拉京0 μmol/L组比较，SiHa细胞凋亡率表现出剂量依赖性，随浓度上升而显著升高，呈现时效与量效关系。柯里拉京诱导SiHa细胞凋亡主要发生在G2阻滞期，见图4。

图4 流式细胞检测柯里拉京诱导SiHa凋亡

3 讨 论

据估计，30%～40%的癌症可以通过饮食和生活方式预防。目前，临床上使用的某些抗癌药物，如紫杉醇和喜树碱，均是从天然产物中提取。由于天然产物的多样性和独特的作用机制，寻找具有抗癌活性的天然产物成为一个值得探索的领域。植物酚酸广泛存在于中草药中，是一类具有潜在抗肿瘤活性的化合物，例如茶叶中的茶多酚已被多次证实具有抗肿瘤效应。

本研究发现，火炭母水提液对宫颈癌细胞的体外抑制作用最佳。对其进行液质色谱分析，发现火炭母水提液中主要为酚酸性物质，柯里拉京是多羟基酚酸的代表性成分。本研究选取了火炭母中的柯里拉京为研究对象，发现其对人宫颈上皮鳞状癌SiHa细胞具有潜在的抗增殖活性。通过流式细胞检测发现，柯里拉京可以将SiHa阻滞在G2期，从而抑制SiHa细胞增殖。柯里拉京的抗肿瘤活性可能通过2个方面来实现：(1)抑制细胞无序增殖的关键蛋白(例如P21)；(2)重新激活细胞正常凋亡通路关键蛋白(例如P53)，重新引导宫颈癌细胞凋亡，但具体的分子机制有待进一步研究确定。

火炭母中富含酚酸类物质，其中多羟基酚酸具有类似的骨架结构。但是作者未研究柯里拉京对正常宫颈细胞的细胞毒性，后续还需要明确柯里拉京是通过何种通路诱导SiHa凋亡。火炭母水提液中的柯里拉京虽然对SiHa细胞有较好的体外抑制作用，然而柯里拉京是否可以联合应用于手术、放化疗中，在临床辅助治疗宫颈癌，还需要进一步的离体、在体试验和临床试验。此外，仍需要分析火炭母中其他类似结构的酚酸，以及火炭母中与柯里拉京骨架结构类似的化合物是否具有相应的活性。