Wnt5a基因慢病毒的构建与RSC96雪旺细胞的感染研究*

韦良臣，杨 琪，曾 晖，翁 鉴，刘 佩，康 斌，钟华戈，于 斐△

(1.北京大学深圳医院骨关节科，广东 深圳 518036；2.骨科生物材料国家地方联合工程研究中心，广东 深圳 518036；3.北京大学深圳医院超声诊断科，广东 深圳 518036；4.广西医科大学附属肿瘤医院胃肠外科，广西 南宁 530021)

周围神经损伤是指周围神经干及其分支受到直接或间接创伤后发生的损伤，常见于体力劳动者，致伤原因包括解剖性原因和损伤性原因。解剖性原因是解剖异常引起周围神经的卡压性损伤；损伤性原因主要由于机械性原因(切割、挤压)、物理性原因(冻伤、烫伤)、缺血性原因(栓塞)、医源性原因(注射、手术)及代谢、肿瘤等造成[1]，可导致躯体的运动、感觉及自主神经功能障碍等一系列症状。周围神经损伤的治疗效果常难以估计，受到损伤部位、损伤原因、机体状况等多种因素影响，若治疗不及时，往往会导致不良后果，严重者甚至会导致残疾，这使得周围神经损伤成为骨科医生的棘手问题。周围神经损伤可通过药物、电刺激等非手术方法和手术方法治疗[2]。随着医学发展，越来越多的神经相关因子被证实与周围神经损伤修复相关，例如传统的神经生长因子、睫状神经生长因子、转化生长因子等[3]，均可促进周围神经损伤后的修复。许多新的因子也能有效实现功能，例如Wnt5a因子[4]。

Wnt5a因子是非经典Wnt信号通路的代表性配体，首先于20世纪90年代被发现，其基因含有5个外显子，起始的631 bp有很强的启动子活性[5]。研究显示，Wnt5a因子可以通过自身所在的非经典Wnt信号通路、核因子-κB(NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等[6]，参与到骨科相关疾病如周围神经损伤、骨关节炎、骨缺损修复等[7]的进程中。雪旺细胞是周围神经系统中的神经胶质细胞，延神经元的突起分布，包裹在神经纤维上形成有髓神经纤维，是周围神经疾病中研究较多的一种细胞。RSC96细胞是一种细胞系，经大鼠原代培养的雪旺细胞长时间培养后自发转化而形成，呈贴壁样生长，能够表达原代雪旺细胞的部分特性，常常用于周围神经损伤相关的疾病研究中，以代替原代雪旺细胞。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的一种病毒载体，对多种细胞均具有感染能力，被广泛应用于表达RNAi的动物及细胞实验中。该病毒可以将外源性基因稳定地整合到宿主细胞的染色体上，从而形成可以传代且表达稳定的外源性基因子代细胞，与只能实现瞬转的逆转录病毒载体比较有较大优势，也较多地被应用于骨科相关研究中[8]。目前，少见学者对RSC96雪旺细胞中应用Wnt5a基因慢病毒进行感染的细胞模型进行报道。本研究中，作者构建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，用其感染RSC96雪旺细胞，观察慢病毒感染情况，检测细胞中Wnt5a mRNA的表达情况，从而建立相关细胞模型，为骨科研究周围神经损伤等相关疾病提供方法学基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞 RSC96雪旺细胞系(中国科学院上海细胞库)；293T细胞(上海细胞所)；Top10感受态细胞(Genechem公司)。

1.1.2主要试剂 人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 p24 Antigen 酶联免疫吸附试验(ELISA) 2.0试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)；苏木素、伊红(北京益利精细化学品有限公司)；Bulge-LoopTMmiRNA 定量聚合酶链反应(qPCR) Primer试剂盒(广州锐博公司)；Trizol(上海普飞公司)；oligo dT(上海生工公司)；嘌呤霉素(Clontech公司、Sigma公司)；NormalRunTM250 bp-Ⅱ DNA Ladder(GeneRay公司)；限制性核酸内切酶(NEB公司)；dNTPs、M-MLV试剂盒、RNA酶抑制剂(Promega公司)；SYBR Master Mixture(TaKaRa公司)；GeneRuler 1 kb DNA Ladder、T4 DNA连接酶(Thermo Scientific公司)；Taq Plus DNA聚合酶(Vazmye公司)。

1.1.3主要仪器 普通光学显微镜(上海彼爱姆光学仪器制造有限公司)；倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)；数显式稳压稳流电泳仪、凝胶成像仪(上海天能公司)；Blue Pard隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；生物安全柜(上海振样创空气净化设备有限公司)；超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司、Thermo Scientific公司)；荧光显微镜(奥林巴斯公司)；聚合酶链反应(PCR)仪(Applied Biosystems 公司)；反转录耗材(Axygen公司)；超速离心机(Beckman Coulter公司、Eppendorf公司)；移液器(Eppendorf公司、吉尔森有限公司)；超细匀浆机(FLUKO公司)；细菌摇床(华利达实验设备公司)；测序仪(美季生物公司)；细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific公司、SANYO公司)；Celigo(Nexcelom公司)；Real time PCR仪器(Roche公司)；高速离心机、Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1RSC96雪旺细胞的HE染色 取适宜量的RSC96雪旺细胞接种于3 cm培养皿，待细胞接近长满进行染色；磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗5 min，2次；4%多聚甲醛固定60 min；PBS冲洗5 min，2次；苏木素浸染3 min，水洗；伊红浸染1 min，水洗；普通光学显微镜下拍照。

1.2.2Wnt5a基因慢病毒载体构建 根据大鼠Wnt5a基因序列设计一条Wnt5a-RNAi靶点序列GGG TGA TGC AAA TAG GCA G，其中GC含量为52.63%，起始位点为614。采用吉凯基因GV248载体构建Wnt5a基因慢病毒框架-a和Wnt5a基因慢病毒框架-b，见表1。引入AgeI和EcoRI作为酶切位点酶切载体，合成单链引物后退火形成双链DNA，后用DNA连接酶将双链DNA与酶切后的载体连接，转化感受态细胞后挑选阳性克隆的菌落进行PCR鉴定(见表2)，测序测通后抽提合格质粒进行后续实验。

表1 Wnt5a基因慢病毒框架

表2 阳性克隆PCR鉴定引物

1.2.3Wnt5a基因慢病毒包装 取293T细胞。离心管中加入含有GV载体质粒20 μg、pHelp1.0载体质粒15 μg、pHelp2.0载体质粒10 μg的各DNA溶液，并与吉凯转染试剂混合调节成1 mL，室温温育15 min。细胞与温育后的液体混匀，37 ℃及CO2培养箱内培养6 h；PBS洗涤后用10%胎牛血清(FBS)再次于培养箱内培养2～3 d；上清液于4 000 g及4 ℃条件下离心10 min；滤器过滤后在25 000 r/min及4 ℃条件下离心2 h；弃上清液后用病毒保存液重悬离心沉淀物；10 000 r/min条件下离心5 min分装保存备用。

1.2.4Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺细胞 采用适宜量的RSC96雪旺细胞铺12孔板，细胞密度为20%时用Wnt5a基因慢病毒进行感染，重复感染3次，每次感染3个复孔，感染复数(MOI)为10，感染条件为Eni.S，感染16 h换液，感染72 h进行观察。

1.2.5感染后RSC96雪旺细胞中Wnt5a mRNA含量检测 以GAPDH为内参(表3)，按照各目的基因退火温度选择二步法完成扩增，通过熔解曲线判断扩增产物特异性，用2-ΔΔCt法进行数据分析。

表3 Wnt5a及GAPDH引物

2 结 果

2.1测序测通结果 根据测序可见，ccg gca GGG TGA TGC AAA TAG GCA Gct cga gCT GCC TAT TTG CAT CAC CCt gtt ttt g可测通。

2.2构建及鉴定Wnt5a基因慢病毒载体 阳性克隆片段及空载体克隆片段在PCR电泳图中可以清晰看到，见图1。

1为阴性对照(加入ddH2O)；2为阴性对照(空载自连对照)；3为Marker(自上而下依次为5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp)；4～8为Wnt5a基因慢病毒转化子鉴定。

2.3包装Wnt5a基因慢病毒并进行滴度鉴定 重组的Wnt5a基因慢病毒质粒感染293T细胞，倒置荧光显微镜下观察可以看到感染后的293T细胞表达绿色荧光，表示病毒包装成功(图2)。

A～H为明场图片；I～P为荧光场图片；A～H及I～P的慢病毒量分别为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6 μL。

2.4RSC96雪旺细胞的形态学观察 普通光镜下观察，可以看到RSC96雪旺细胞贴壁后呈梭形、三角形或多角形，细胞拥挤处呈铺路石样外观(图3A)；苏木-伊红(HE)染色后可以看到，RSC96雪旺细胞的细胞核呈较深的粉红色或紫色，形态主要为圆形；RSC96雪旺细胞的细胞质呈较浅的粉红色或紫色，形态与光镜下观察类似，呈梭形、三角形或多角形(图3B)。

A为普通光镜下观察；B为HE染色后观察。

2.5Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺细胞 用滴度为109TU/mL的Wnt5a基因慢病毒感染12孔板中生长密度为20%的RSC96雪旺细胞，MOI为10，感染后在Celigo细胞成像分析仪下观察可以看到，感染后的RSC96雪旺细胞表达绿色荧光，并且可以看到细胞的状态较好，没有污染，见图4。

2.6感染后RSC96雪旺细胞中Wnt5a基因mRNA表达情况 分别用Wnt5a基因慢病毒感染3次RSC96雪旺细胞，RSC96雪旺细胞中Wnt5a mRNA的表达量分别为0.211±0.028、0.259±0.027、0.148±0.005，平均表达量为0.206±0.056。

A为明视野下的RSC96雪旺细胞；B为荧光视野下的RSC96雪旺细胞。

3 讨 论

Wnt基因最早于1982年的乳腺癌相关研究中被发现，被学者命名为Int1基因。之后，学者在果蝇的相关研究中发现了与Int基因高度同源的无翅基因(Wingless)，后将两者合称为Wnt基因[9]。由Wnt基因调控的通路即为Wnt信号通路，该通路可分为经典的Wnt/β-catenin信号通路和非经典的Wnt/PCP信号通路、Wnt/Ca2+信号通路。其中，Wnt5a主要属于非经典的Wnt信号通路。Wnt5a基因定位于染色体3p14.2-p21.1区，人的Wnt5a蛋白与鼠99%同源[10]。Wnt5a基因在细胞增殖、内环境稳态维持、器官发育中具有重要作用，并可以通过PTEN、MAPK、NF-κB等信号通路影响周围神经、中枢神经损伤修复或功能重塑[4]。周围神经损伤是临床上的棘手问题，尤其是损伤严重及大段缺损条件下，由于周围神经损伤及修复机制不明确，临床无法对其有效干预。雪旺细胞是周围神经中非常重要的神经胶质细胞，对周围神经损伤修复机制的研究意义重大。RSC96细胞是一种能够多次传代并表达雪旺细胞特性的大鼠来源细胞系，可以部分代替原代雪旺细胞用于周围神经损伤修复的研究。

研究证实，Wnt5a基因可以通过调控雪旺细胞的功能，进而影响周围神经的损伤修复。PAN等[11]发现，Long non-coding RNA NONMMUG014387可以通过靶向激活Wnt/PCP通路,促进损伤部位周围雪旺细胞的增殖，这一过程中Wnt5a蛋白的表达量明显升高，其可能影响了雪旺细胞的去分化和增殖，在周围神经再生中起重要作用。SHARMA等[12]认为，Wnt5a在自体骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的过程中发挥作用，从而在一定程度上提高了周围神经损伤修复及神经元轴突再生的临床细胞生物利用度。TIONG等[13]则认为，褪黑素可以通过Wnt信号通路中的Wnt5a因子，影响糖尿病周围神经病变中雪旺细胞的凋亡。SIMONETTI等[14]通过动物模型证实，阻断脊髓背根神经元Wnt5a-Ryk/Ror2轴可阻止活动依赖性树突棘重塑，显著降低外周损伤和炎症引起的机械性超敏反应，从侧面证实了Wnt5a基因在周围神经损伤修复中的作用。

慢病毒是在HIV基础上发展起来的一种病毒载体，对分裂及非分裂的细胞均具有较强的感染力。本研究团队早期利用SIRT1基因慢病毒感染了ATDC5软骨细胞，以及利用PTEN基因慢病毒感染了RSC96雪旺细胞[15-16]，并发现敲减ATDC5细胞中的SIRT1基因可以引起该细胞的退变[17]。PARK等[18]通过VEGF基因慢病毒感染胃癌细胞，发现感染后可影响胃癌细胞增殖和肿瘤生长。MA等[19]发现通过IARS2基因慢病毒感染人黑色素瘤A375细胞，证明该慢病毒可调控A375细胞的增殖及凋亡。CUI等[20]发现CRAD慢病毒感染人肺癌细胞，可通过claudin4调节人肺癌细胞生长及凋亡。由此可知，慢病毒感染技术在医学及生物学研究中应用广泛。但是，Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺细胞的相关模型少有报道，因此本研究团队构建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并用其感染了RSC96雪旺细胞，通过绿色荧光的表达观察到慢病毒感染情况。细胞中Wnt5a mRNA的平均表达量为0.206±0.056。

当然，本研究也存在一定的不足之处。首先，本研究是一个描述性、观察性研究，仅仅介绍了构建Wnt5a基因慢病毒的方法及其感染RSC96雪旺细胞后的mRNA表达情况，缺乏对照组，也缺少蛋白层面的检测。其次，细胞模型只能在离体条件下证明Wnt5a基因的作用，仍需要动物模型进一步证明其与细胞实验中的一致性，这些也是作者需要继续研究的内容。

综上所述，本研究构建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并成功利用其感染了RSC96雪旺细胞，检测了其Wnt5a mRNA表达量。通过建立相关细胞模型，可为周围神经损伤修复的相关研究提供参考。