电针联合运动训练对大鼠受压坐骨神经再生及肢体运动功能的影响研究*

张娟娟，杨菊芬，李雪飞，杨 曼

(河南省直第三人民医院康复医学科， 河南 郑州 450000)

周围神经损伤是手足外科常见疾病，坐骨神经损伤是其主要类型，可导致感觉障碍、肌肉萎缩、运动能力降低[1]。近年来，坐骨神经损伤发病率不断升高，年确诊人数超百万，严重降低患者生活质量[2]。临床治疗坐骨神经损伤通常采用糖皮质激素、神经营养因子、免疫抑制剂等药物治疗及显微外科修复术等方式,但药物治疗周期长、疗效存在较大的提升空间；手术虽可精准解除卡压而为周围神经再生创造有利条件，但鉴于神经再生速度慢、肌肉萎缩、周围组织水肿粘连等因素神经再生的效果并不理想[3]。因此，探索促进神经再生、促进肢体运动能力恢复的高效的治疗手段对坐骨神经损伤的治疗意义重大。穴位针刺是中医常用治疗方式，是用针灸针刺入人体的特定穴位，使能量进入或离开从而使阴阳恢复平衡。目前穴位针刺与运动训练治疗周围神经损伤的临床疗效已被证实，但其对周围神经再生的作用机制尚不清楚[4]。本研究通过建立受压坐骨神经大鼠模型，研究电针联合运动训练对受压坐骨神经再生及肢体运动功能的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级雄性SD大鼠45只，6周龄，体质量(200±10)g，购自上海灵畅生物科技有限公司，实验动物生产许可证编号为SCXK(沪)2018-0003，动物质量合格证号为2020A054，在河南中检检测技术有限公司饲养并进行实验，使用许可证编号为SYXK(豫)2018-0006。

1.2 药品、试剂与仪器

LY294002，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路阻断剂，上海麦克林生化科技有限公司产品，批号154447-36-6；兔抗大鼠Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、mTOR、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)一抗,均为美国Abcam公司产品，批号依次为ab8805、ab8933、ab134903、ab109268。6805-C电针仪，上海三崴医疗设备有限公司产品；IX-400型多导生理记录仪，美国iWorx公司产品；DM750光学显微镜，德国徕卡公司产品；DYY-8C型电泳仪、WD-9413A型凝胶成像分析系统，北京六一生物科技有限公司产品。

1.3 动物分组与模型的建立

在45只大鼠中随机选择10只设为假手术组，剩余大鼠按照参考文献[5]方法制备受压坐骨神经模型。俯卧位手术台固定，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，右侧臀线处备皮消毒，剪开皮肤，切口长约20 mm，钝性分离皮下，暴露梨状肌和坐骨神经，止血钳夹持梨状肌下方5 mm处5 s，松开，缝合伤口。假手术组大鼠仅暴露梨状肌和坐骨神经，缝合伤口。术后每天观察大鼠一般情况，出现左后肢跛行、蜷缩表示造模成功。共有32只大鼠成功建立受压坐骨神经模型，将其随机分为模型组(11只)、电针联合运动训练组(11只)、电针联合运动训练+LY294002组(10只)。

1.4 治疗方法

自模型建立成功第7天开始干预。电针联合运动训练组：根据《实验针灸学》[6]选取大鼠左侧环跳穴(髋关节后上部)、阳陵泉穴(腓骨小头前下缘)、殷门穴(后肢上部中心)、承山穴(后肢腓肠肌凹陷点)，将电针仪电针正极接于环跳、阳陵泉穴，对应负极接于阳陵泉、承山穴，以频率200 Hz、电流强度2 mA进行电针治疗，每日15 min，持续10 d；此外，将大鼠置于DB-YLS-15A型小动物转轮式跑步机(北京智鼠多宝生物科技有限责任公司产品)上，以5转/min进行跑台训练，每日5 min，持续10 d。电针联合运动训练+LY294002组在电针联合运动训练组治疗基础上皮下注射LY294002 4 μg/g[7]；假手术组、模型组和电针联合运动训练组尾静脉注射1 mL生理盐水，均为干预第1天一次性用药。

1.5 检测指标与方法

治疗结束1 d后进行斜板实验与坐骨神经传导速度检测；然后，各组大鼠禁食禁水6 h，腹腔注射戊巴比妥钠深度麻醉，脱颈处死；摘取左右两侧完整腓肠肌及左侧坐骨神经；将坐骨神经组织分为3份，2份以40 g/ L多聚甲醛固定，用于免疫组化染色及苏木精-伊红(HE)染色，1份投入液氮中，用于蛋白检测。

1.5.1 运动功能

采用斜板实验检测大鼠运动功能[8]，于干预1 d后进行。将两块矩形合金板用铰链连接，分别作为底板和旋转板，下方放置橡胶垫缓震。将大鼠头向前垂直放置于水平旋转板中央位置，缓慢旋转铰链使底板与旋转板角度增大，从0°起逐次增加5°，记录每只大鼠停留5 s不跌落的最大角度，测试3次，取平均值。实验前10 min将大鼠带入实验房间适应环境，保持房间安静。每只大鼠实验结束后擦拭板体以防影响后续实验。

1.5.2 坐骨神经传导速度

采用神经电生理检测大鼠坐骨神经传导速度。将大鼠俯卧位固定于手术台，按1.3项下操作，暴露坐骨神经，将多导生理记录仪刺激、记录电极分别接于坐骨神经近心、远心端，设置采集频率100 kHz，灵敏度4 mV，时间常数0.2 s，刺激电压1 V，波宽0.1 ms。坐骨神经传导速度=刺激电极与记录电极的距离/潜伏期时间[9]。测试3次，取平均值。

1.5.3 腓肠肌恢复率

取大鼠左右两侧完整腓肠肌，分别测量湿重，计算腓肠肌恢复率。腓肠肌恢复率(%)=左侧腓肠肌湿重(g)/右侧腓肠肌湿重(g)×100%

1.5.4 坐骨神经微血管密度(MVD)

采用免疫组织化学染色法检测坐骨神经MVD。取40 g/L多聚甲醛固定的坐骨神经组织，梯度蔗糖脱水，聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物包埋，12 μm厚度冰冻切片，CD34免疫组织化学染色。显微镜下观察神经微血管密度，以单个内皮细胞或棕色内皮细胞群为一个血管，200倍镜下随机选择5个血管密集区视野，记录血管数量，求平均值。

1.5.5 坐骨神经的组织病理学观察

取40 g/L多聚甲醛固定的坐骨神经组织，流水冲洗25 min，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，冷却，4 μm厚度切片，常规脱蜡，酒精水化，HE染色，滴入封片剂封片，显微镜下观察坐骨神经的组织病理学形态。

1.5.6 坐骨神经组织Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达

采用Western blot法检测。取液氮保存的坐骨神经组织，用研磨器研磨，PBS洗涤匀浆，注入离心管；加入RIPA细胞裂解液，冰上8 500 r/min离心(离心半径10 cm)15 min，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒定量蛋白；取40 μg样品与上样缓冲液按体积比1∶5混合，沸水浴加热5 min，离心取上清，电压80 V行上样电泳分离；电压110 V湿转硝酸纤维素膜，摇床清洗、体积分数50 mL/L脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗膜；加入兔抗大鼠Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，常温孵育2 h，TBST洗膜；加入ECL发光液显色，暗室曝光，经一体式凝胶成像系统扫描拍照，分析灰度值。以Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白/内参GAPDH灰度值表示Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠运动功能对比

与假手术组对比，模型组大鼠斜板实验最大角度减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，电针联合运动训练组大鼠斜板实验最大角度增加(P<0.05)。与电针联合运动训练组对比，电针联合运动训练+LY294002组大鼠斜板实验最大角度减少(P<0.05)。结果表明，电针联合运动训练可改善运动功能，而LY294002可减弱其作用。见表1。

表1 各组大鼠斜板实验最大角度对比

2.2 各组大鼠坐骨神经传导速度对比

与假手术组对比，模型组坐骨神经传导速度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，电针联合运动训练组坐骨神经传导速度升高(P<0.05)。与电针联合运动训练组对比，电针联合运动训练+LY294002组坐骨神经传导速度降低(P<0.05)。结果表明，电针联合运动训练可改善周围神经传导能力，而LY294002可减弱其作用。见表2。

表2 各组大鼠坐骨神经传导速度对比

2.3 各组大鼠腓肠肌恢复率对比

与假手术组对比，模型组腓肠肌恢复率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，电针联合运动训练组腓肠肌恢复率升高(P<0.05)。与电针联合运动训练组对比，电针联合运动训练+LY294002组腓肠肌恢复率降低(P<0.05)。结果表明，电针联合运动训练可改善大鼠神经功能，而LY294002可减弱其改善作用。见表3。

表3 各组大鼠腓肠肌恢复率对比

2.4 各组大鼠坐骨神经MVD对比

与假手术组对比，模型组坐骨神经MVD升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明受压坐骨神经的MVD增加。与模型组对比，电针联合运动训练组的坐骨神经MVD升高(P<0.05)。与电针联合运动训练组对比，电针联合运动训练+LY294002组坐骨神经MVD降低(P<0.05)。结果表明，电针联合运动训练可促进坐骨神经血管新生，LY294002可减弱其作用。见表4和图1。

表4 各组大鼠坐骨神经MVD对比 条·视

A：坐骨神经CD34表达量少B、C、D组：坐骨神经CD34表达量增加，其中C>D>B图1 各组大鼠坐骨神经CD34阳性表达情况(免疫组织化学染色法，×400，标尺25 μm)

2.5 各组大鼠坐骨神经组织病理学形态对比

假手术组：神经组织结构完整，神经纤维排列整齐，神经元轴突、髓鞘连接正常。模型组：神经组织结构破坏严重，神经纤维排列紊乱，神经元轴突、髓鞘连接断裂，细胞肿胀变性。电针联合运动训练组、电针联合运动训练+LY294002组：神经组织结构较清晰，神经纤维排列较为整齐，出现明显增生，部分神经元轴突、髓鞘连接断裂，细胞增殖现象明显。电针联合运动训练组的组织病理学改善程度更优。见图2。

图2 各组大鼠坐骨神经组织病理学形态(HE染色法，×400，标尺25 μm)

2.6 各组大鼠坐骨神经组织p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值对比

与假手术组对比，模型组坐骨神经组织p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明受压坐骨神经大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路活性增强。与模型组对比，电针联合运动训练组坐骨神经组织p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值升高(P<0.05)。与电针联合运动训练组对比，电针联合运动训练+LY294002组坐骨神经组织p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值降低(P<0.05)。结果表明，电针联合运动训练可促进受压坐骨神经大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路活性增强，LY294002可减弱其作用。见表5和图3。

表5 各组大鼠坐骨神经组织Akt/p-Akt 、mTOR/p-mTOR对比

A.假手术组；B.模型组；C.电针联合运动训练组；D.电针联合运动训练组+LY294002组图3 各组AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达对比(Western blot法)

3 讨 论

坐骨神经损伤表现为运动、感觉的功能障碍，即主动运动消失、肌无力、肌萎缩、感觉减退、出汗减少、皮肤粗糙、角质层薄化等[10]。坐骨神经损伤属中医学“痹证”“痿证”范畴，病机为邪风痹阻经脉、外感湿毒、饮食劳倦、跌打损伤等致肢体筋骨病变、血气痹阻、气血虚耗、五脏伤损，从而发病，治疗根本在于祛邪通络、补虚固本。

神经传导速度体现了周围神经的传导能力。坐骨神经损伤后神经传导能力受限，传导速度降低[11]。小腿腓肠肌湿重是神经功能恢复的重要指标，可反映神经纤维再生情况。坐骨神经损伤可致肌力下降、肌肉萎缩，故肌肉湿重降低。神经MVD与神经再生、功能恢复速度密切相关[12]。CD34抗体是微血管内皮细胞特异性标志物，常用其标记新生血管[13]。本研究结果显示，与模型组对比，电针联合运动训练组大鼠斜板实验最大角度增加，神经传导速度增快、腓肠肌恢复率升高、坐骨神经MVD升高，提示电针联合运动训练可提升大鼠肌力及运动能力，促进周围神经功能恢复、神经微血管再生。有研究[14]认为，电针可促进家兔外周面神经损伤的再生、面部神经及肌肉功能恢复，抑制神经元凋亡，提示电针对于神经损伤具有治疗作用。良好的血液循环是神经再生及功能恢复的基础，运动训练可显著改善血液供应，加快血液循环速度，促进神经再生。电针与运动训练联合可发挥协同作用，提升肢体运动功能，强化周围神经损伤治疗效果[15]。

PI3K/Akt/mTOR通路是机体经典信号通路，广泛参与机体能量吸收、基础代谢等过程[16]。Akt是PI3K下游关键效应分子，是一种重要生长因子调节介质，可发生磷酸化而发挥其生物学效应。mTOR是Akt下游重要靶蛋白，可被活化的Akt激活发生磷酸化，间接激活效应分子蛋白，参与神经元突触形成，促进神经细胞生长分化[17]。研究[18]认为，激活PI3K/Akt通路可减少坐骨神经损伤大鼠神经元细胞凋亡，在神经功能的再生和重建过程中起到关键作用。本研究结果显示，与假手术组对比，模型组坐骨神经组织p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高，经电针联合运动训练后进一步升高，且在电针联合运动训练基础上增用PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂LY294002可减弱电针联合运动训练对大鼠受压坐骨神经再生的促进作用，提示电针联合运动训练可能通过调控该通路促进大鼠受压坐骨神经再生。

综上所述，电针联合运动训练可促进大鼠受压坐骨神经再生及肢体运动功能恢复，可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。