跑台运动训练对脊髓损伤大鼠肺功能及HMGB-1表达的影响

王志涛，陈源，王凤霞，陈彦，王先斌,2，吴霜,2

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后肺不张、呼吸衰竭等严重并发症是造成SCI患者高死亡率的主要原因[1-2]。除高位脊髓损伤可造成严重的神经源性呼吸动力障碍之外，脊髓损伤后继发的肺损伤也是导致脊髓损伤患者呼吸功能障碍，甚至致死的重要原因。有研究发现，在肺损伤大鼠肺组织中检测到的高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-1 protein,HMGB1)较正常对照组明显升高，通过抑制HMGB1的表达和分泌，可明显减轻大鼠肺损伤程度，提高大鼠的存活率[3]。而跑台运动训练作为肺康复的主要康复训练方法，被广泛应用于SCI、脑卒中等疾病的康复治疗中[4-5]。研究证实通过跑台运动训练能够提高全身各肌群包括呼吸肌群的肌力和肌耐力，并改善1秒用力呼气量(FEV1)等多项肺功能指标，改善心肺储备功能[5-6]。但其对脊髓损伤后继发的肺损伤会造成何种影响，目前未见明确报道。本实验通过对胸段SCI大鼠进行跑台运动训练后的带氧能力、肺组织病理学改变、HMGB1表达水平变化等指标的检测以探究跑台运动训练对胸段脊髓损伤后大鼠肺功能，及肺组织内HMGB1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SPF级6周龄SD雌性大鼠，200±20g，实验动物来源：贵州医科大学附属医院实验动物中心，质量合格证编号SYXK(黔)2018-0001：本动物实验经贵州医科大学附属医院实验动物伦理委员会审查通过。适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常组、假手术组、脊髓损伤非训练组、脊髓损伤训练组，每组各24只。实验过程中动物处置均符合贵州医科大学附属医院动物实验伦理委员会标准。

1.2 方法 ①动物模型制备及术后护理：大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉。俯卧位四肢外展固定于手术台，常规术区备皮、消毒，铺无菌孔巾。以T10棘突为中心，沿棘突做纵行切口约2 cm，切开皮肤及浅筋膜，并皮下游离。尖刀片紧贴棘突骨面两侧(以减少因切开肌肉所致肌间出血)做椎旁肌纵行切开，显微撑开器撑开两侧椎旁肌，暴露术野，咬除T10棘突，显露椎板，蚊式止血钳横向轻轻钳夹摩擦椎板直至显露硬膜囊外间隙。由尾侧向头侧咬除椎板直至两侧椎弓根，完整暴露脊髓。参考赵雪燕等[7]方法，眼科手术刀于T10节段处连同硬脊膜和脊髓一同快速切断，可见大鼠后肢痉挛性抽搐数次后软瘫，切除2 mm宽脊髓组织，并以弯头显微镊轻抬起脊髓两断端，直视下两人证实脊髓完全横断。创口敷洒庆大霉素。逐层缝合肌肉、筋膜、皮肤，术毕。假手术组仅剥离椎板，不伤及脊髓，其他处理均同脊髓横断组。大鼠分笼饲养，室温(23±2)℃，相对湿度(50±10)%，明暗12h交替，饮食水自由摄取。术后常规每日庆大霉素(2～4)×104 U/kg 腹腔注射。每天按摩、挤压膀胱协助排尿2～3次。为预防肠梗阻和压疮的发生，每日轻揉大鼠腹部及双后肢2次并保持皮毛干燥。脊髓损伤非训练组和脊髓损伤训练组在造模过程中各有3只于术后2～24h死亡，予以及时补充。②干预方法：脊髓损伤后运动组大鼠于术后第3天开始跑台运动训练，训练过程中根据大鼠前肢运动情况选择跑台内置的声音、光照刺激及跑道与大鼠足趾接触处给与电流刺激，保证大鼠维持在跑道上的持续运动，每日早晚各训练1次，每次训练时间为15min，速度为15m/min[8]。

1.3 评定标准

1.3.1 大鼠运动功能评价 分别在造模前、造模后即刻、造模后第3天及第14天对所有大鼠采用双盲法用BBB评分表进行运动功能评价[9]，该评分表分值为0～21分，0分表示无可见后肢运动，21分表示活动正常。

1.3.2 动脉血气分析 对各组大鼠于术后第3天、第14天经大鼠腹主动脉取动脉血1.5ml做动脉血气分析，观察并记录动脉氧分压值(partial pressure of oxygen,PaO2)、动脉二氧化碳分压值(partial pressure of carbon dioxide,PaCO2)。

1.3.3 肺组织湿/干重比检测 各组大鼠分别于术后第3d、14d经水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠整肺，用滤纸吸干表面水分，在电子天平上称重，得到肺湿重，将肺组织放到65℃烘箱中72h烘干至恒重，在电子天平上称重，得到肺干重，计算二者之比。

1.3.4 肺组织HE染色及肺损伤评分 各组大鼠分别于术后3d、14d经水合氯醛腹腔注射麻醉，自左心室插管后剪开右心耳，快速灌注生理盐水冲洗，待流出的液体清亮后，用4%多聚甲醛经心内灌注，取出右下叶肺组织，在4%多聚甲醛中固定12 h，入30%蔗糖磷酸盐缓冲液至组织块下沉为止。石蜡切片制作15 μm厚切片以备做HE染色及免疫组织化学染色。取各组大鼠肺组织切片进行HE染色，切片在二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)中各脱蜡10min。顺次将切片移入无水乙醇2min、95%、90%、80%乙醇各1min，蒸馏水洗2min。苏木素染色5min，自来水冲洗。使用0.5%盐酸乙醇(70%乙醇配制)分化，提插数下。自来水浸泡15min。使用0.5% 伊红染液染色2min。依次移入80%、90%、95%及无水乙醇中各1min 进行脱水。二甲苯透明2 次，各5min。中性树脂封片。最后在光镜下观察，并用图像采集系统留取图片。

1.3.5 肺损伤评分 分别对各组大鼠肺组织进行肺损伤评分[10]，取组内评分，平均值作为各组大鼠的肺组织损伤程度评分。肺损伤评分标准为：①肺泡充血和间质水肿:无异常为0分，轻度异常为1分，中度异常为2分，重度异常为3分;②肺内出血：无红细胞为0分，极少数为1分，较多数为2分，充满肺泡腔为3分；③肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集：无白细胞为0分，极少数为1分，较多数为2分，充满肺泡腔为3分；④肺泡壁增厚和透明膜形成：无透明膜形成为0分，<20%肺泡出现透明膜为1分，20%～50%肺泡出现透明膜为2分，>50%肺泡出现透明膜为3分。

1.3.6 免疫组织化学染色 取各组大鼠肺组织切片投入PBS缓冲液，经抗原修复液95℃存放20 min，缓冲液清洗2次，再入3%H2O2溶液内，室温20 min，以消除内源性过氧化物酶。然后，切片孵育在10%山羊血清溶液中1h，以减少非特异性反应。一抗Anti-HMGB1(兔单克隆抗体)经1%山羊血清与0.15%Triton X100缓冲液配制。每片滴加100μ一抗Anti-HMGB1(1∶200，货号：ab79823，Abcam公司)后，在4℃孵育过夜，次日经缓冲液洗涤3次后，加相应抗兔二抗(1∶400，货号：ab6721，Abcam公司)溶液，室温孵育1 h，缓冲液洗涤3次。底物呈色反应剂采用DAB(货号：CDLG-4456，北京中杉金桥生物技术有限公司)。呈色反应后，切片经逐级脱水并中性树脂封片。每例标本测5张切片。HMGB1阳性率的计算采用阳性着色细胞计数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工计数阳性着色细胞和视野内的总细胞数，每组5张不同动物组织切片，取被检各切片之均值。HMGB1阳性率=HMGB1阳性细胞数/细胞总数×100%。

2 结果

2.1 BBB评分 正常组和假手术组大鼠BBB评分术前、术后第3天、第14天均为21分；SCI非训练组和SCI训练组BBB评分术前均为21分，术后第3天评分均为0分，术后第14天评分均为0～1分。术后14天 SCI非训练组和SCI训练组BBB评分差异无统计学意义。

2.2 动脉血气分析 术后第3天，正常组与假手术组比较，PaO2、PaCO2差异无统计学意义；与正常组及假手术组比较，SCI非训练组、SCI训练组PaO2均显著降低，PaCO2均显著升高(均P<0.05)；SCI非训练组与SCI训练组比较，PaO2、PaCO2差异无统计学意义。术后第14天，正常组与假手术组比较，PaO2、PaCO2差异无统计学意义；与正常组及假手术组比较，SCI非训练组、SCI训练组PaO2均明显低于正常组及假手术组，PaCO2均明显高于正常组及假手术组(均P<0.05)。组内术后第14天分别与术后第3天比较，SCI非训练组和SCI训练组PaO2均明显升高，PaCO2均明显降低(均P<0.05)，且SCI训练组较SCI非训练组PaO2升高更显著，PaCO2下降也更显著(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠PaO2、PaCO2术后比较

2.3 肺组织湿/干重比 术后第3天，正常组与假手术组肺组织湿/干重比值差异无统计学意义；SCI非训练组、SCI训练组肺组织湿/干重比值均显著高于假手术组(均P<0.05)；SCI非训练组与SCI训练组肺组织湿/干重比值差异无统计学意义。术后第14d，正常组与假手术组肺组织湿/干重比值差异无统计学意义；SCI非训练组肺组织湿/干重比值明显高于假手术组(P<0.05)；与SCI非训练组比较，SCI训练组肺组织湿/干重比值明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠肺组织在不同时间点湿/干重比值比较

2.4 肺组织HE染色 HE染色结果显示，正常组和假手术组各时间点肺泡结构完整，无红细胞渗出及炎性细胞浸润，正常组和假手术组无明显差别，见图1；SCI非训练组和SCI训练组大鼠损伤3d后肺组织中毛细血管扩张充血，肺泡壁增厚及肺间质可见红细胞、炎性细胞浸润，肺泡破裂，部分肺泡腔融合，见图2(A、C)；与术后第3天比较，术后第14天SCI非训练组、SCI训练组红细胞、炎性细胞浸润、肺泡破裂，部分肺泡腔融合等程度均有所减轻，且SCI训练组较SCI非训练组减轻更加明显，见图2(B、D)。肺损伤评分结果如表3所示。各组大鼠术后第14天，正常组与假手术组肺损伤评分，差异无统计学意义；SCI非训练组、SCI训练组肺损伤评分均显著高于假手术组(均P<0.05)，且SCI训练组显著低于SCI非训练组(P<0.05)。术后第14天，与假手术组比较，SCI非训练组、SCI训练组肺损伤评分均显著增高(均P<0.05)；且SCI训练组显著低于SCI非训练组(P<0.05)。与术后第3天比较，术后第14天SCI非训练组、SCI训练组肺损伤评分均显著降低(P<0.05)。且SCI训练组肺损伤评分显著低于SCI非训练组(P<0.05)。

图1 A～C 肺组织形态学；A.正常组14dHE染色结果；B.假手术组术后3d染色结果C.假手术组术后14dHE染色结果；比例尺=200μm

图2 A～D 肺组织形态学及肺损伤评分结果；A.非训练组术后3d HE染色结果；B.非训练组术后14d HE染色结果；C.训练组术后3d HE染色结果；D.训练组术后14d HE染色结果；比例尺=100μm

表3 4组肺损伤评分结果比较 分，

2.5 肺组织HMGB1蛋白免疫组化检测 各组肺组织HMGB1蛋白免疫组化检测结果见图3A～F。术后第3天，与假手术组比较，SCI非训练组和SCI训练组肺组织中HMGB1蛋白的表达水平均显著升高(均P<0.05)；SCI非训练组与SCI训练组比较，肺组织中HMGB1蛋白的表达水平无明显变化，差异无统计学意义。术后第14天，与假手术组比较，SCI非训练组和SCI训练组肺组织中HMGB1蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)；但SCI训练组HMGB1表达量显著低于SCI非训练组(P<0.05)；且SCI训练组组内比较，术后第14天HMGB1的表达水平明显低于术后第3天时HMGB1的表达水平(P<0.05)。见表4。

图3 A～F 各组肺组织HMGB1蛋白免疫组化检测结果；HMGB1蛋白阳性如红色箭头所示。A.假手术组，术后3d；B.假手术组，术后14d；C.脊髓损伤非训练组，术后3d；D.脊髓损伤非训练组，术后14d；E.脊髓损伤训练组，术后3d；F.脊髓损伤训练组，术后14d。比例尺=50μm。

表4 4组HMGB1阳性率结果比较

3 讨论

脊髓损伤不仅导致损伤平面以下的运动、感觉等功能障碍，还将继发多种并发症，呼吸功能障碍就是其中致死率最高的一种[11]。目前研究认为SCI后发生继发性肺损伤的机制主要包括以下两方面：①SCI后全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)：SCI后早期不仅会引起损伤脊髓局部的炎症，还会导致全身炎症反应综合征，造成多器官功能障碍，而肺是SCI后全身炎症反应作用的主要靶器官，SCI后循环炎症细胞激活并向肺、肝、肾等远隔器官迁移，在多种细胞因子的参与下，最终导致继发性肺损伤[12]；②神经源性肺水肿：神经源性肺水肿是以中枢神经系统严重损害后肺水肿急性发作作为主要特征的一种临床综合征，可由脊髓损伤引起[13]。有研究已证实了以上两种假说，如Bo等[1]用改良Allen法建立大鼠T10水平脊髓挫伤模型，结果发现SCI后12h，肺组织病理切片可见出血性病变，尤其是双肺下叶，伤后24h出现肺水肿，伤后3d出血、水肿达高峰，伤后7d水肿明显减轻，14d后仍可见明显出血。Wu等[12]用打击法建立大鼠T10水平SCI模型，伤后3d肺组织病理切片出现充血、水肿、肺泡结构破坏等肺损伤表现。这些研究表明，大鼠胸段脊髓损伤将会引起肺损伤，其机制可能即存在远隔器官的炎症反应，也存在神经源性的肺水肿。本研究结果显示，T10水平损伤的大鼠SCI非训练组及SCI训练组，损伤后第3天肺组织病理切片显示毛细血管扩张充血，肺泡及肺间质红细胞、炎性细胞浸润，肺泡破裂，部分肺泡腔融合，肺组织湿/干重比值升高，PaO2下降，PaCO2升高，结果同以往研究一致。本实验还发现，在第14天时SCI及SCI训练组肺组织病理程度均较前减轻，肺组织湿/干重比值降低，PaO2较前上升，PaCO2较前降低，提示大鼠SCI后的肺损伤可能存在一定的自限性。

大量研究证明，跑台运动训练可保护脊髓损伤后的骨骼肌质量和脊柱四肢的残余力量，还可能参与调节脊髓损伤后抑制性递质的水平，如GABA和甘氨酸[14-15]。而早期跑台运动训练可能通过减轻损伤脊髓水肿、减轻炎症反应、降低细胞凋亡、减少相关信号通路对神经干细胞增殖分化的抑制作用，从而改善SCI后大鼠运动功能[16]。大鼠脊髓损伤节段以上的呼吸肌群作为跑台运动中提供有氧代谢的动力，在运动功能得到改善的同时也可得以加强。Ching等[17]的研究发现跑台运动可减轻糖尿病大鼠内毒素血症时肺组织病理损伤，同时使PaO2升高，PaCO2下降，降低内毒素血症大鼠死亡率。本实验结果显示经过14d跑台训练的SCI训练组大鼠各项肺功能指标均显著优于SCI非训练组，我们推测跑台运动训练可能有利于大鼠胸段脊髓损伤后肺损伤的恢复，但其机制不明。

HMGB1作为一种新的炎症介质参与炎症反应的调节，如参与了脑卒中、急性心肌梗死、关节炎、哮喘等多种疾病的发生[18-21]。与CXCL12结合的完全还原的HGMB1，在组织损伤的初始阶段介导炎性细胞的募集，从而诱导单核细胞的迁移，并调节中性粒细胞的黏附和迁移功能[22]。HMGB1还可介导TNF /IL-1，IL-6，IL-8，CCL2，CCL3，CCL4和CXCL10等细胞因子/趋化因子的释放，从而参与炎症反应的调节[23,25]。目前认为在原发性的肺损伤的发生发展中，HMGB1可能发挥着重要的作用，研究证实在大鼠肺损伤后，大鼠HMGB-1 mRNA在肺组织中的表达明显升高[25]。Liu等[26]的研究指出肺损伤大鼠服用芍药醇后可通过抑制HMGB1的表达和分泌，从而使肺损伤大鼠的存活率得到提高。本实验通过对脊髓损伤后大鼠进行跑台运动训练，明显抑制了大鼠肺组织内HMGB1的表达，大鼠肺功能和肺组织损伤程度均较SCI非训练组获得明显改善，提示HMGB1可能参与并介导了SCI后肺损伤的发生，跑台运动训练可能通过下调炎症介质HMGB1的表达，从而减轻了全身炎症反应所致的肺损伤。

通过跑台运动训练可明显减轻大鼠SCI后肺损伤程度，并下调HMGB1的表达，改善SCI后大鼠肺功能。具体机制还需进一步实验研究，有望为临床指导治疗脊髓损伤后肺损伤提供新的理论依据。