5-Aza-cdR通过DNA甲基化调节BDNF参与学习记忆的机制*

张世纪，付 翁，贾小娥，巴德仁贵，姜树原，谢雅彬，霍东升，谢 伟，刘晓蕾，邵 国

(1.包头医学院内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室,内蒙古 包头 014040；2.包头医学院基础医学与法医学院；3 包头医学院医学技术与麻醉学院神经科学研究所)

5-氮-2’脱氧胞苷( 5-Aza-2'-deoxycy- tidine, 5-Aza-cdR)是一种有效的 DNA 甲基化抑制剂。5-Aza-cdR 可以与DNA甲基转移酶活性位点的半胱氨酸之间形成共价键，从而抑制DNA甲基转移酶的作用。有研究发现5-Aza-cdR 对小鼠学习记忆的影响可能与小鼠海马体中p-Y1472 NR2B磷酸化的增加有关。尽管研究表明5-Aza-cdR 可以影响学习记忆，但相关分子机制有待深入研究[1]。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是一种碱性蛋白，是神经营养因子之一。BDNF在下丘脑、杏仁核、海马、新皮质等脑区高表达，参与各种神经活动[2]。BDNF的表达和分泌，提升海马锥体神经元的树突状棘密度，并诱导海马长时程增强产生。有研究证实，提高BDNF的水平可以改善衰老导致的记忆障碍。还有研究发现BDNF可以通过参与神经细胞的生长发育及调节突触可塑性等方面，调节大脑海马区的学习记忆功能[3]。

BDNF在突触可塑性和学习记忆中的作用已经被证实是不可或缺的，而最新研究发现 DNA 甲基化可以通过调控BDNF表达来影响学习记忆[4]。然而DNA甲基化参与BDNF表达和调节学习记忆能力的机制尚不清楚。因此，本文通过研究5-Aza-cdR影响DNMT功能后，对BDNF表达以及学习记忆的影响，从而为后续DNA甲基化研究特别是在学习记忆方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 离心机、超声波破碎仪、恒温摇床、酶标仪、金属浴、电泳仪、转膜仪、化学发光仪、实时荧光定量PCR仪、激光共聚焦显微镜、BCA浓度定量试剂盒，抗氧化剂、PVDF膜、10XTBS、吐温20、Trizol裂解液、反转录试剂盒、SYBR Green mix、引物、一抗、96孔板、二抗等。

1.2动物及分组 6～8周龄的SPF级雄性ICR小鼠70只，体质量18～22 g，购自于斯贝福 (北京) [SCXK ( 京) 2016-0002]生物技术有限公司，所有小鼠在自然通风饲养室中自由摄入水和食物，适应性饲养24 h。注射PBS为C组，25只；注射5-Aza-cdR 为注射组，30只；注射K252a为K252a注射组，15只。本研究经包头医学院实验动物伦理委员会批准。

1.3动物处理 小鼠用1.2 %的戊巴比妥钠溶液麻醉，以俯卧位固定于脑立体定位仪上。消毒，在头顶切开一长约1.5 cm的切口，按照标准小鼠脑立体定位图谱，以十字缝交叉点为原点，按照十字缝原点右1 mm、十字缝前0.5 mm的位置上为点做标记，使用颅骨钻孔器钻孔；钻孔后以孔位为原点，使注射器针头向下进入2.5 mm，缓慢注射10 μL 10 μ/M 5-Aza-cdR 或10 μL10 μ/M K252a工作液。注射后停针5 min，使药品充分进入脑内，然后缓慢退针。缝合切口后放入单独鼠笼保温等待苏醒。C组注射等量0.01M PBS缓冲液。 注射5-Aza-cdR 或K252a 24h后，将小鼠断头处死，在冰上剥离海马，置于1.5 mL EP管中，立即放入-80 ℃冰箱中冻存。

1.4Real-time PCR检测 使用Trizol法提取总RNA，使用Thermo公司反转录试剂盒。将RNA反转录为cDNA，-20 ℃ 保存。引物由生物工程( 上海) 有限公司合成，DNMT3B基因、BDNF 基因和 β-Actin 基因引物的设计见表 1。Real-time PCR实验重复3次。

表1 Real-time 基因引物序列

1.5Western blot 电泳 将冻存于-80 ℃冰箱中的小鼠海马于冰上融化。每个海马样品中加入300 μLRIPA裂解液，蛋白酶抑制剂3 μL。使用超声波破碎仪破碎；4 ℃ 、12 000 rcf、离心15 min；吸取上清液到新的EP管中。使用BCA蛋白盒测定蛋白浓度。蛋白电泳时上样质量为20 μg，条件为先恒流19 mA，然后29 mA，转膜4 h，将蛋白转移到PVDF膜上。室温下使用5 %的脱脂牛奶35 r/min孵育1.5 h，使用1XTBST洗膜3次，每次15 min。一抗(1∶1000) 4°C过夜孵育，1XTBST洗膜三次，每次15 min。辣根过氧化物酶驴抗兔和山羊抗小鼠二抗(1∶1000) 35 r/min孵育1.5 h，1XTBST洗膜3次，每次15 min。ECL超敏发光液发光检测蛋白表达情况，实验重复3次。

1.6免疫荧光染色 小鼠使用1.2 %戊巴比妥钠麻醉后，心脏先后灌注30 mL生理盐水和30 mL 4 %多聚甲醛，取出全脑放入4 %多聚甲醛中后固定过夜，后更换30 %PB蔗糖脱水72 h，OTG包埋后进行冠状位冰冻切片，厚度20 μm。10 %NGS室温封闭1 h后分别使用BDNF和CaV1.2的特异性一抗4 ℃孵育过夜，0.3 %PBST清洗3次后室温使用Alexa Fluor 488、594避光孵育4 h，0.3 %PBST清洗3次后Hoechst 33342 室温避光染核后封片。每组实验重复 3 次以上。

2 结果

2.1小鼠海马中DNMT3B表达变化 与C组相比，5-Aza-cdR 注射组小鼠海马中DNMT3B蛋白表达水平降低(P<0.05)(图1A)；与C组相比，5-Aza-cdR 注射组小鼠海马中DNMT3B mRNA表达水平也降低(P<0.05)(图1B)。

图1 DNMT3B蛋白和RNA表达

2.2小鼠海马中BDNF表达变化 与C组相比，5-Aza-cdR 注射组小鼠海马中BDNF蛋白表达升高(P<0.05)(图2A)；与C组相比，5-Aza-cdR 注射组小鼠海马中BDNF RNA表达也升高(P<0.05)(图2B)。

图2 BDNF蛋白和RNA表达

2.3小鼠海马区BDNF的表达变化 采用免疫荧光检测法，蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为BDNF蛋白，免疫荧光显示BDNF定位于小鼠海马脑区(图3A)。注射5-Aza-cdR 后，与C组相比小鼠海马脑区的BDNF荧光强度显著增强(P<0.05)(图3B)。

图3 不同处理组小鼠海通过免疫荧光检测BDNF变化的结果

2.45-Aza-cdR处理增强小鼠的空间学习记忆能力 与C组相比，5-Aza-cdR 注射组小鼠的潜伏期时间趋势在第1～6天明显变短(P<0.05)；K252a注射组小鼠的潜伏期时间与C组相比明显变长(P<0.05)(图4D)。与C组相比，5-Aza-cdR 注射组小鼠在目标象限时间的百分比增加明显(P<0.05)；K252a注射组小鼠的目标象限时间的百分比明显减少(P<0.05)(图4E)。与C组相比，5-Aza-cdR 注射组小鼠的穿梭平台次数明显增加(P<0.05)；K252a注射组小鼠的穿梭平台次数明显减少(P<0.05)(图4F)。

图4 水迷宫结果

3 讨论

5-Aza-cdR 是一种DNA甲基转移酶的抑制剂，已被批准用于各种条件的临床治疗。5-Aza-cdR可以提高水迷宫中小鼠的学习和记忆能力，并抑制PP1γ的表达来提高小鼠的学习记忆能力。5-Aza-cdR 研究了DNA甲基化在神经发育、分化、突触学习记忆可塑性以及主要神经元生存中的作用。研究发现，海马CA1区域的p-Y1472 NR2B受到5-Aza-cdR 的影响，对成人小鼠大脑的记忆形成和突触可塑性具有重要意义[5]。本研究得出在大鼠海马神经元中注射5-Aza-cdR后，DNA 甲基化水平显著降低，伴随BDNF基因表达上调，同时大鼠的学习能力也明显提升。

BDNF是德国神经生物学家 Barde在 1982年首次从猪脑中分离纯化出的一种碱性蛋白，是神经营养因子之一[6]。研究表明，增加 BDNF 的表达和分泌，可以提升海马锥体神经元的树突状棘密度，并诱导海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)的产生[7]；通过调节神经元分化，影响血清素能和多巴胺能神经传递。BDNF能在突触前和突触后靶位点充当旁分泌和自分泌因子，从而对突触活动转化为长期突触记忆至关重要。 BDNF 被认为是中枢神经系统中功能和结构可塑性的指导性介质。在海马体中BDNF还影响成人神经发生，进而对多种形式的学习和记忆产生作用[8]。

DNA 甲基化可以通过调控 BDNF 表达来影响学习记忆[4]。在大鼠海马神经元中，DNA 甲基化水平显著降低，伴随BDNF基因表达上调，同时大鼠的学习能力也明显提升[9]。还有研究指出，DNMT 抑制剂 RG108 可以在短时间内增加 BDNF 表达量，而且伴随着基因启动子中特定 CPG 岛甲基化的增加，可以增强神经元的突触可塑性，提高认知能力[10]。一部分脑卒中患者会同时患有焦虑障碍，而脑卒中患者 BDNF 基因的高甲基化则与焦虑有关；BDNF作为卒中后焦虑障碍的易感性标靶，应受到密切监测，以明确焦虑是否发生，特别是在卒中恢复期[11]。K252a是一种有效的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂，抑制蛋白激酶C(PKC)，PKA，钙/钙调蛋白依赖性激酶II型与磷酸酶激酶，可以阻断注射5-Aza-cdR对BDNF下游信号通路的影响。

先前的研究表明，5-Aza-cdR 可以降低DNMTs的表达，本研究提取小鼠海马进行Real-time PCR实验和Western blot 电泳实验发现5-Aza-cdR 可以抑制小鼠海马中DNMT3B的表达， DNA甲基化水平很可能因此降低，从而可以提高小鼠海马中BDNF的蛋白表达。通过水迷宫实验发现，BDNF参与了小鼠学习记忆的过程，也证实5-Aza-cdR在上调BDNF表达后，可能提升小鼠的学习记忆能力。由于在BDNF 启动子区域有大量CpG 岛，注射5-Aza-cdR 后，DNMT3B的水平降低，而BDNF的蛋白和RNA表达水平均升高。因此，5-Aza-cdR 可以抑制DNMT3B的表达，降低 BDNF 启动子区域的甲基化水平上调 BDNF 表达，从而提升小鼠的学习记忆能力。

有研究发现，在恐惧学习的环境中，可以快速增加记忆抑制基因蛋白磷酸酶1的甲基化，同时对可塑性相关基因的启动子区域去甲基化。恐惧学习的经验提高了大脑海马体中DNMT3A和DNMT3B的表达，对DNMT1 没有影响[12]。因此，DNA甲基化虽然对记忆的形成至关重要，但不太可能是一种长期储存的机制。 进一步的研究发现，在恐惧学习环境中，海马体中的BDNF外显子III和外显子IV启动子去甲基化，这表明DNA甲基化可以通过BDNF影响学习记忆[13]。