铁死亡与急性肾损伤及其防治

陈颐华，张利鹏 *

（1内蒙古医科大学研究生学院，呼和浩特010050；2内蒙古医科大学附属医院重症医学科，呼和浩特010050）

急性肾损伤（Acute kidney injury, AKI）AKI是一种复杂的综合征，发生在各种临床环境中，包括败血症、肾毒性和急性心力衰竭。AKI发生时肾功能突然恶化，伴有含氮废物滞留、电解质和细胞外容量失调。临床表现为短时间内（≤3个月）肾功能突然或持续下降，代谢废物和毒物在体内积聚，严重者可发展至肾功能衰竭甚至死亡[1]。传统上AKI的诊断需要血肌酐升高和（或）持续6小时尿量＜0.5ml/kg/h。AKI是一种复杂的综合征，发生在各种临床环境中，包括败血症、肾毒性和急性心力衰竭。AKI是一个可预防的问题，如果不加以治疗，它会继续造成进一步的伤害，并且与预后不良有关。AKI的特点主要是肾小管上皮细胞的损伤。越来越多的研究证实铁死亡（ferroptosis）与AKI有密切联系，探索铁死亡与AKI的关系，对AKI临床有着重要意义。

1 铁死亡的定义

近几年来，更多新的细胞死亡方式逐渐被发现[2]。2012年，铁死亡作为一个新的细胞死亡方式被Dixon等人提出[3]。铁死亡是一种铁依赖性非凋亡调节性细胞死亡，其特征是大量脂质过氧化物积累，这是通过破坏谷胱甘肽依赖性脂质过氧化物防御系统引起的[4]。与细胞凋亡和焦亡等其他形式的细胞死亡相比，铁死亡具备独特的形态学特征和生物学表现。发生铁死亡时，细胞膜破裂起泡，细胞核缺乏染色质凝聚，线粒体减少，线粒体尺寸减小，双层膜密度增加，线粒体嵴减少或消失，线粒体外膜破裂[5]。

2 铁死亡的发生过程

随着近几年对铁死亡的广泛研究，逐渐证明铁离子紊乱、胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白系统（cystine/glutamate antiporter system, Xc-）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4） 的下降是铁死亡发生的主要原因，因此铁代谢、氨基酸代谢和脂质代谢(尤其是脂质过氧化)与铁死亡具有密切联系。

2.1 铁代谢

铁对生命至关重要，因为它在氧转运、DNA修复、细胞增殖和许多其他关键生化过程中起着关键作用。身体中的铁大部分源于衰老的红细胞，吞噬细胞吞噬衰老红细胞后，降解血红素释放出二价铁。一部分二价铁通过转运蛋白运出细胞，运出的二价铁被铜蓝蛋白氧化成三价铁，然后与转铁蛋白结合，接着通过膜蛋白转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）进入细胞。在细胞中，经过铁还原酶的作用又被还原为二价铁。最后，通过二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）的作用将二价铁释放到细胞质不稳定的铁池中[6]。二价铁与过氧化氢发生反应，产生具有强氧化性的羟基自由基，此反应称之为芬顿反应，铁含量超载可通过此反应导致氧化损伤，进而启动铁死亡。另一部分二价铁储存在铁蛋白中，铁蛋白是由重链（ferritin heavy polypeptide，FTH ）和轻链（ferritin light polypeptide，FTL）组成的蛋白质复合物，用于铁的储存，因此被认为是重要的内源性铁螯合剂，其浓度能够表明身体的铁储备。铁蛋白重链的氧化酶作用能够将二价铁转化为三价铁，从而减少循环中的二价铁，有效减少氧化导致的细胞损伤[7]。

2.2 氨基酸代谢

铁死亡与氨基酸代谢联系密切。正常生理状态下，谷氨酸和胱氨酸通过胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白1∶1相互交换，之后胱氨酸还原为半胱氨酸[3]。谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸利用ATP依赖性胞质酶谷氨酸半胱氨酸连接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）和谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）合成一种细胞内必须的抗氧化剂——还原型谷胱甘肽（GSH）。GSH能够被GPX4用来消除含有多不饱和脂肪酸的磷脂中形成的脂质过氧化物。谷氨酸和谷氨酰胺是铁死亡重要的调节剂，细胞外高浓度的谷氨酸能抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运系统，减少还原型谷胱甘肽的生成，进而诱导铁死亡。谷氨酰胺诱导铁死亡必须利用谷氨酰胺的分解产物，在没有谷氨酰胺的情况下，或当谷氨酰胺分解受到抑制时，胱氨酸输入受阻并不能诱导铁死亡。小分子蛋白erastin诱导铁死亡的方式为抑制胱氨酸的输入，导致谷胱甘肽的减少和GPX4的失活。总之任何能够抑制还原型谷胱甘肽生成及抑制GPX4活性的物质都可以使脂质过氧化物蓄积，导致铁死亡[8]。

2.3 脂质代谢

铁死亡的特点在于脂质活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的铁依赖性增强。细胞膜或细胞器膜，因为较高的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），所以容易受到 ROS 损伤，这一过程称为脂质过氧化。GPX4是唯一可以直接还原生物膜中产生的磷脂氢过氧化物的抗氧化酶。它在氧化稳态中具有重要作用，通过使用谷胱甘肽作为GPX4的辅助因子来中和脂质过氧化物并保护膜流动性，以保护细胞和膜免受过氧化。GPX4将GSH转化为氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 并将脂质过氧化物L-OOH还原为相对应的醇 L-OH。随后，GSSG被谷胱甘肽还原酶和NADPH/H+还原，再次生成GSH，抑制GPX4可导致ROS增加，有研究结果显示：缺失 GPX4 的小鼠在胚胎第8天后无法存活，这表明在正常哺乳动物发育过程中，GPX4是必不可少的[9]。铁死亡涉及一个重要的氧化反应，花生四烯酸（arachidonic acid， AA）和肾上腺酸（adrenic acid，AdA）通过酰基辅酶A合酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）驱动发生酯化反应生成磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）[10]。PE与磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1）结合与15-脂氧合酶（15-lipoxygenase，15-LO）的两个亚型（15-LO-1和15-LO-2）形成复合物，并通过变构修饰显示出铁死亡的信号Sn2-15二十碳四烯酰基-磷脂酰乙醇胺（sn2-15-HpETE-PE），最后利用脂氧酶（lipoxidase lipoxygenase，LOXs）氧化生成脂质氢过氧化物，进而诱发铁死亡[11,12]。

3 铁死亡与急性肾损伤

急性肾损伤的发病机制主要是肾小管上皮细胞的损伤。随着铁死亡的深入研究，大量的实验证明了铁死亡对AKI有着重要影响。GPX4是铁死亡发生过程中十分重要的调节因子，Angeli等人的研究发现敲除GPX4后的老鼠易发生AKI，并且存活时间较短，在抑制脂质过氧化后，减少因缺乏GPX4诱导的细胞死亡，存活时间延长。此实验进一步证明铁死亡在AKI中发挥的作用[13]。

横纹肌溶解时，肌红蛋白中的铁以及肌红蛋白本身都可导致不受控制的脂质过氧化反应，从而诱导肾功能损伤[5]。近期Guerrero-Hue等人的研究充分证明了铁死亡在横纹肌溶解诱导的AKI中起着关键作用，并发现姜黄素（curcumin）是一种能够抑制细胞铁死亡的抗氧化剂[14]。另外一项研究发现，如果横纹肌溶解的AKI模型的肾小管上皮细胞缺失FTH，便容易发生氧化反应和损伤，由此间接证明了横纹肌溶解诱导的急性肾损伤与铁死亡有着密切的关系[15]。

一定剂量的叶酸（folic acid，FA）可在肾脏中结晶，但是大剂量的叶酸会对肾脏造成损伤，进而诱导AKI。Martin-Sanchez等人的研究显示，在叶酸诱导的AKI模型中，可以观察到高水平的肾小管上皮细胞脂质过氧化，使用铁抑素（ferrostatin-1, Fer-1）能有效抑制肾小管上皮细胞脂质过氧化；实验过程中利用尿素氮（BUN）和肌酐值评估，发现Fer-1处理能改善肾功能[16]。由此表明，在叶酸诱导的AKI中，肾小管上皮细胞的损伤与铁死亡有着密切联系。

缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）是AKI的一个常见病因，肾脏缺血后再恢复灌注时ROS的产生会引发一系列有害的细胞反应，进而导致肾小管上皮细胞发生进行性损伤和死亡[17]。在过去，研究认为细胞凋亡是缺血/再灌注导致的损伤中最重要的细胞死亡方式[18,19]。现在，随着铁死亡的深入了解，大量研究发现铁死亡在缺血/再灌注导致的损伤中占主导地位。在一项研究中，Linkermann等人通过活细胞成像技术在I/R诱导的急性肾损伤模型中观察到铁死亡可直接导致肾小管同步坏死。Choi研究发现，心脏手术中低水平的铁结合蛋白可能导致在心肺转流期间快速处理铁释放的能力受损，易导致急性肾损伤[20]。此实验结果强调铁稳态在人类缺血/再灌注损伤中的重要性，反映铁死亡铁离子调节这条通路在I/R导致的AKI中的重要作用。

顺铂是一种使用广泛的化疗药物，但是具有较强的肾毒性，是诱导AKI的原因之一[21]。有研究通过小鼠模型来观察铁死亡在顺铂诱导AKI的过程中发挥的作用发现，顺铂可以使小鼠肾脏的转铁蛋白受体-1和铁蛋白的表达增加并且铁含量升高；铁死亡的标志物也随着顺铂的给药量而增加。由此可见铁死亡在顺铂诱导AKI的过程中起关键作用[22]。

4 铁死亡与各种AKI的治疗

随着对铁死亡的深入研究，大量的试剂被证明可以调节铁死亡，目前各种试剂主要通过调节脂质过氧化反应、铁离子及铁蛋白、GPX4、谷胱甘肽来调节铁死亡。

4.1 叶酸导致的AKI

叶酸导致的AKI（FA-AKI）的特点是氧化还原稳态的紊乱，出现大量肾小管坏死和炎症。Li等人的实验结果显示，A-硫辛酸（LA）作为一种抗氧化剂，对叶酸诱导的肾功能障碍起保护作用。LA不仅通过上调铁蛋白和铁转运蛋白（transferrin）的表达来减少细胞铁超载，而且通过增加GSH 和谷胱甘肽过氧化物酶的水平来减轻ROS的积累和脂质过氧化[23]。 Li等人的另外一项研究发现了一种抗氧化因子（FG-4592）在FA-AKI的发展中有重要影响。给小鼠模型注射FG-4592后，小鼠的肾功能有所改善，细胞中的铁、丙二醛等铁死亡标志物减少，表明铁超载和脂质过氧化得到了抑制。同时，研究发现了FG-4592可以激活Nrf2，导致血红素加氧酶1（OH-1）、GPX4、胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白以及铁转运蛋白表达增加，进而降低铁死亡的风险[24]。Li等人的实验研究了荷叶碱（nuciferine）对小鼠叶酸诱导的急性肾损伤的影响，在FA-AKI小鼠模型中，荷叶碱治疗能减轻病理改变和炎症反应，改善肾功能。从机制上讲，荷叶碱通过防止铁积累和脂质过氧化显著抑制铁死亡。此外，GSH和GPX4的敲除消除荷叶碱对铁死亡的保护作用。这些实验为FAAKI的治疗提供了新的策略[25]。

4.2 缺血/再灌注导致的AKI

肾对缺血/再灌注十分敏感，氧的供需不匹配导致氧化代谢减少，从而造成肾功能受损。 Zhao等人的研究用I/R模型不仅证明了肾小管上皮细胞的铁死亡，而且发现肾小管细胞中能够促进铁死亡的ACSL4的表达与肾功能下降的严重程度相关，并且还发现一种铁死亡的抑制剂——XJB-5-131（一种线粒体靶向抗氧化剂）对肾，特别是肾小管上皮细胞具有较高的亲和力，能够减轻肾的损伤，促进肾小管上皮细胞增殖和修复，减少肾脏炎症和抑制脂质过氧化，但不影响坏死性凋亡的潜力和I/R模型中的细胞焦亡[26]。miRNAs是一类小的非编码RNA，在I/R诱导的肾损伤中，miR-182-5p和miR-378-3p上调，通过下调GPX4和溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）进而激活铁死亡[27]。另外一项研究发现，一种名叫槲皮素（quercetin）的天然类黄酮能够抑制近端肾小管上皮细胞铁死亡。主要机制是降低丙二醛 (MDA) 和脂质活性氧 (LOS) 水平和升高GSH 水平。这些实验充分反映出研究发现的铁死亡抑制剂很可能成为未来急性肾损伤的治疗方式[28]。

4.3 顺铂导致的AKI

顺铂具有较强的肾毒性，包括急性肾损伤的发作，因此使用受到极大限制。毫无疑问，治疗顺铂诱导的AKI（Cis-AKI）的有效药物在临床上迫切需要。Zhou等人的实验表明，在Cis-AKI 模型中，虎杖甙（polydatin，PD）对铁死亡有抑制作用，其特点是细胞内过度的游离铁蓄积和ROS生成减少，丙二醛 (MDA) 含量降低以及谷胱甘肽、GPX4的活性增加[29]。Hu等人发现激活维生素D受体（VDR）对Cis-AKI具有保护作用。VDR的激动剂能够通过减少脂质过氧化、4-羟基壬醛 (4HNE) 和丙二醛(MDA)，在组织学上和功能上减弱顺铂诱导的AKI，同时改善GPX4的下降，如果敲除VDR基因，会表现出更多细胞的铁死亡以及更严重的AKI[30]。肌醇加氧酶（myo-inositol oxygenase，MIOX）是近端肾小管的特异性酶，在肾小管细胞损伤中起关键作用，过度表达会加重AKI中的细胞损伤[31]。Deng等人通过观察脂质过氧化程度以及其他铁死亡标志物的变化证明了MIOX过表达能加重细胞铁死亡，破坏其基因可减少这种细胞损伤[32]。该研究为Cis-AKI的治疗提供了新思路。

5 结语

铁死亡是一种可通过多种机制调控，以脂质过氧化为特征的程序性死亡形式，是一种新发现的细胞死亡方式，备受关注。在各种AKI模型中，可见铁死亡通过铁代谢、氨基酸代谢、脂质代谢等3个途径导致AKI的发生，并有多种物质可通过抑制铁死亡来保护肾脏，但作用机制并未完全清楚。需要在急性肾损伤领域对铁死亡进行更全面、更深入的研究，从而为AKI的防治以及相关药物的研发奠定基础。