自噬与皮瓣缺血再灌注损伤

张团庄，宋渊*，刘涛，姚兴璋

（1甘肃中医药大学，兰州730030；2甘肃省中医院，兰州730050）

随着科技的进步和社会的发展，工业、农业和交通运输业也紧跟社会步伐，开放性损伤也逐渐见增多，这类损伤处理棘手。在临床上，解决组织缺损，目前最有效的手段就是皮瓣移植[1,2]，但是在皮瓣移植的过程中，皮瓣会因为缺血性坏死。而提高皮瓣的成活率则是改善皮瓣的血液循环，降低缺血再灌注损伤。皮瓣缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion，I/R）是指皮瓣在较长时间缺血的情况下重获血液灌流或氧供后反而损伤加重的现象[3]。虽然皮瓣设计和手术技术都有了改进，但其长宽比仍不能超过1.5~2:1，限制了[4]的临床应用。目前I/R损伤的发病机制尚不十分清楚，既往研究发现血供不足、炎症反应和氧化应激是导致皮瓣坏死的3个重要因素[5]。近年来，对于I/R损伤防治的研究越来越多，研究发现，内皮细胞是皮瓣I/R损伤的关键靶点之一[6]，缺血后的处理与血管内皮细胞保护有关。也有学者研究发现I/R损伤中自噬对于皮瓣防治有一定的关系[7]。氧化应激和自噬凋亡是I/R的2个主要机制[8]，是导致随意皮瓣坏死的关键因素。激活自噬是维持细胞稳态的重要手段，可以提高皮瓣的存活率。越来越多的研究表明，缺血甚至坏死是由于氧化应激和血供[7]不足所致。因此，抑制氧化应激和加速血管生成是促进随机模式皮瓣存活的主要策略。而目前在甘肃省中医院受医生和患者认可的，是由甘肃省中医院李盛华教授研制的消肿止痛合剂。该药在临床使用多年，疗效显著，但机制尚未清楚[9,10]。课题组在前期研究发现，消肿止痛合剂使血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor,VEGF）、Notch和Dll4 蛋白表达量显著升高，促进新生血管生成和皮瓣成活[11]。I/R本是一类综合征，发病机制复杂，从单一的靶点很难有效的缓解或治愈。因此，深入研究整体调节、多靶点、多系统作用机制且毒副作用小的药物，是I/R治疗中新的策略和方法。课题组探讨消肿止痛合剂PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响机制，从而寻找中药治疗皮瓣I/R的作用靶点。现对近几年自噬对皮瓣成活率影响进行综述，为后期的课题研究提供思路和参考。

1 自噬概述

自噬是细胞对内外界环境压力变化的一种反应，是细胞通过单层或双层膜，包裹待降解物形成自噬体，然后运送到溶酶体形成自噬，溶酶体并进行多种酶的消化及降解，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新过程[12,13]。自噬是一种高度保守的真核细胞再循环过程，可降解胞质大分子和细胞器，在血管生成、氧化应激和凋亡中发挥关键作用[14]。自噬调节多种内皮细胞受体的表达，包括神经纤维蛋白的降解，然后促进血管生成[15]。自噬是发生在所有真核细胞[14]中的一个稳态过程。在一个动态循环系统中，自噬产生新的构建模块和能量用于细胞更新和稳态[16]。然而，不适当的自噬可损害血管生成[17]。自噬在调节血管生成、凋亡和氧化应激中起着重要作用，抑制自噬可以促进血管生成，可促进细胞凋亡和坏死的氧化应激相关产物，如活性氧（reactive oxygen species, ROS）[18]是自噬的重要激活物[16]。但是自噬在细胞存活中的作用是一把“双刃剑”，其在许多疾病中被激活以促进细胞存活，如急性心肌梗死，但过度激活自噬可能引发细胞死亡[19]。

2 自噬与皮瓣缺血再灌注损伤

自噬是一种细胞内溶酶体分解代谢的过程，在维持和调节细胞内稳态上发挥重要的作用[20]。自噬调节的完整性、有序性有利于维持细胞的生理功能[21]，I/R是指由于缺血肢体、组织、器官恢复血供后，出现的更加严重的损伤，自噬作为I/R的主要作用机制，揭示了细胞内修复及损伤的过程，而这在I/R的发生发展中尤为重要。

2.1 自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤逆转药物有益作用

3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine；3-MA）是一种众所周知特异性的自噬抑制剂[22-24]， 其首次被发现是通过从饥饿大鼠分离的肝细胞中筛选出来的嘌呤相关物质[24,25]。在皮瓣自噬中，3-MA抑制自噬，进一步提高皮瓣的成活率。相关研究发现成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor, FGF21）、丹参酚酸B、芹菜素、桦木酸、二甲双胍、骨化三醇和天麻素均[26-32]能使皮瓣自溶蛋白相关蛋白CTSD、基质金属蛋白酯（matrix metalloprotein ester,MMP9）、VEGF、SOD1、eNOS和HO1的表达水平升高，增加Cadherin5血管密度，使p62、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、Bax、CYC和 CASP3的表达水平降低，增加血管生成，抑制氧化应激和凋 亡。FGF21激活AMPK-FoxO3a-SPK2-CARM1和AMPK-mTOR信号通路，导致细胞内TFEB表达增加，从而增强缺血皮瓣的组织自噬[26]。芹菜素通过促进血管生成、抑制氧化应激和凋亡来促进随机皮瓣的存活，进而提高皮瓣存活率[27]。综上所述，FGF21等药物主要通过增强自噬，促进血管生成，抑制氧化应激反应和细胞凋亡促进皮瓣的成活。目前，没有发现任何关于3-MA在临床应用的报道。如果在临床中阻断自噬是有必要的，应该确定更安全的替代方法。因此，需要进一步的研究来确定药物调节自噬是否是一种安全的临床治疗方法。

2.2 TFEB核转位诱导自噬

TFEB是一种新的自噬和溶酶体生物发生的积极调节因子，其可通过激活AMPKα和内皮细胞的自噬来调节血管生成[33]。假人参皂苷F11（pseudo ginsenoside F11, PF11）可通过上调Bcl-2，下调Bax和C-caspase3表达，增加SOD1、HO1和eNOS、VPS34、Beclin1、LC3II和CTSD的表达水平。PF11通过AMPK-mTOR信号通路增加TFEB的核转位，最终诱导自噬，增加自噬通量，促进皮瓣血管生成，减轻氧化应激，抑制细胞凋亡，促进皮瓣的成活[34]。利拉鲁肽通过ampk mcoln1-钙调神经磷酸酶信号通路激活TFEB，导致其去磷酸化和核转位，从而激活随机皮瓣组织中的自噬[35]。有研究发现艾塞那肽激活AMPK-mTOR和amp-skp2-carm1信号通路，促进TFE3核易位，激活自噬，增加MMP9、VEGF和Cadherin 5表达水平，降低IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、GSDMD-N和Caspase-1的表达，增强血管生成，减少氧化应激，抑制焦亡，最终改善皮瓣存活[36]。由此可见，TFEB的核转位，诱导自噬升高或降低其相应蛋白水平，均可促进皮瓣成活。

2.3 多区域穿支皮瓣自噬

穿支皮瓣是指仅以管径细小（0.5～0.8 mm）的皮肤穿支血管供血的皮瓣[37]。随着严重创伤、烧伤等引起的皮肤缺损尺寸的增大，应设计更大区域的穿支皮瓣来覆盖巨大的皮肤缺损。因此，寻找一种有效的方法来提高多区域穿支皮瓣的存活率非常必要。使用自噬诱导剂雷帕霉素联合丁苯酞治疗穿支皮瓣，雷帕霉素治疗的所有组，均表现出过度自噬状态，即皮瓣坏死面积增加，血管生成减少，细胞凋亡和氧化应激显著增加[38]。经丁苯酞单独处理发现激光多普勒血流计值提高，VEGF、CDH5、 MMP9、SOD1、eNOS和HO1表达增加，Bax、CYC和CASP3表达减少，丁苯酞可以抑制自噬，改善血管生成，减少氧化应激和凋亡，促进多区域穿支皮瓣模型大鼠皮瓣存活[38]。因此，丁苯酞抑制自噬可能是提高多区域穿支皮瓣存活率的一种新机制。法舒地尔可通过增加beclin-1、降低p62和LC3Ⅰ/LC3Ⅱ，提高细胞自噬水平，促进穿支皮瓣成活；缓激肽可以通过增加血管生成、促进NO释放、抑制细胞凋亡、减少氧化应激和抑制自噬来促进多区域穿支皮瓣的存活[39]。羟基红花黄A（HSYA)可降低自噬相关蛋白beclin1、LC3II、VPS34、CTSD、p62等的表达水平，增强DH5、MMP9和VEGF的水平，促进穿支皮瓣的血管生成[41]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α；HIF-1α）可诱导多区域穿支皮瓣自噬，而自噬增加可激活细胞凋亡，增加氧化应激，对术后早期穿支皮瓣生存产生不利影响[42]。因此，将自噬调控到最佳水平可能是治疗 IR的关键，但尚无研究证实 IR不同病程阶段的最佳自噬水平，有待未来的研究继续探索。

2.4 自噬减轻缺血再灌注损伤

氧化应激和自噬凋亡是IR的两个主要机制[11]，是导致随意皮瓣坏死的关键因素。有研究显示，缺血后处理对皮瓣再灌注损伤有保护作用，该作用可能和自噬激活有关[43]。白藜芦醇（resveratrol, Rev）上调beclin1、LC3II、VPS34和CTSD的表达，降低SQSTM1/p62的水平，这表明它激活皮瓣的自噬，显著提高皮瓣的存活率[44]。研究表明骨化三醇具有抗炎作用，通过加速血管生成、减少氧化应激和上调自噬水平来促进皮瓣存活[45]。也有报道称，黄芪甲苷通过增加平均血管密度，上调VEGF蛋白表达水平，抑制白细胞浸润，降低炎症蛋白TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，增加SOD活性，降低MDA含量，刺激自噬[46]。因此，药物激活自噬，增加血管生成，抑制细胞凋亡和氧化应激促进皮瓣成活。自噬是IR的重要病理机制之一，可以被众多中药复方、中药单药及中药活性成分调控。IR的进展与皮瓣自噬异常密切相关，故治疗重在恢复皮瓣的正常自噬。

2.5 PI3K/Akt信号通路促进皮瓣成活

PI3K/Akt信号通路广泛存在于各类细胞中，是参与细胞生长、增殖、凋亡、分化调节和葡萄糖转运的重要信号转导通路，其异常活化能使多种下游底物被激活，从而导致正常细胞向恶性细胞的转化，增强细胞的增殖、转移、侵袭能力，并可抑制细胞凋亡[47]。研究发现，PI3K/Akt信号通路在皮瓣自噬发生发展起关键作用[48]，心莲内酯和姜黄素通过激活PI3K/Akt信号通路减少随机模式皮瓣的凋亡，二者皆能有效增加皮瓣中自噬蛋白LC3II、beclin1的表达，降低p62的表达水平，促进氧化应激指标HO1、eNOS和SOD1表达，降低凋亡因子CYC、Bax、CASP3水平，促进新生血管、降低氧化应激、抑制凋亡过程来提高随机皮瓣的存活率[48,49]。Sit可以通过激活PI3K/AKT 信号通路介导的自噬，能够抑制穿支皮瓣的抗凋亡作用，增强促血管生成和抗氧化应激来促进其生存[50]。由此可见，自噬可能具有改善穿支皮瓣生存的潜力，PI3K/Akt信号通路可增强皮瓣自噬，促进皮瓣成活起着关键作用。

3 总结与展望

目前对于皮瓣I/R中皮瓣自噬的研究较少。本文分别从自噬抑制剂3-MA、TFEB核转位诱导自噬、多区域穿支皮瓣自噬、自噬减轻缺血再灌注损伤、PI3K/Akt信号通路促进皮瓣成活5个方面着手进行归纳总结，系统阐述了现代医学以及传统医学对皮瓣缺血再灌注损伤中皮瓣自噬的研究现状。目前通过自噬抑制剂3-MA逆转药物作用，对比相应药物对皮瓣自噬的机制，发现通过增加血管的生成，减少氧化应激反应和减少细胞凋亡促进皮瓣存活率。值得注意的是，HIF-1α可诱导多区域穿支皮瓣自噬，而自噬增加可激活细胞凋亡，增加氧化应激，对术后早期穿支皮瓣生存产生不利影响，但是HIF-1α对于皮瓣血管生成的增加作用大于激活细胞凋亡和增加氧化应激对皮瓣的不利。与此相比，Sit诱导的自噬抑制了穿支皮瓣的抗凋亡作用，但仍能增强促血管生成和抗氧化应激来促进其生存，众多研究表明自噬对I/R具有双向调节作用，自噬清除体内受损细胞和代谢产物等的过程实质是机体自主调节的表现，这一平衡是维持机体结构稳定和生理机能协调的基础。目前对于增强或抑制自噬对皮瓣I/R的研究还停留在动物实验，如果需要在临床上使用药物来调节自噬，需要确定药物的浓度或确定更安全的替代方法。

皮瓣I/R是皮瓣移植术后皮瓣坏死的主要原因，是经常困扰临床医生的难题。近年来，I/R损伤的相关防治被广泛研究，但皮瓣缺血再灌注损伤涉及多种损伤机制。文章重点讨论了自噬在皮瓣缺血再灌注损伤中的作用，归纳自噬对皮瓣I/R的保护作用及相应机制。综上所述，自噬在皮瓣I/R中并非单一的机制作用，各种机制相互协同，相互促进，形成一系列的反应来促进皮瓣的成活。但是，自噬对皮瓣缺血再灌注的保护作用及具体的机制目前仍然不清楚。国内外学者通过研究证实PI3K/Akt/mTOR信号通路在脑组织缺血缺氧后调节自噬的发生发展中起着关键作用。前期课题组就消肿止痛合剂对皮瓣缺血再灌注损伤的研究未考虑自噬与其相关作用，目前课题组基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨消肿止痛合剂对皮瓣缺血再灌注的机制研究，为中药治疗皮瓣坏死提供依据。相信随着深入的研究，找到自噬通路中的关键靶点，揭示皮瓣缺血再灌注中自噬的机制，为I/R的治疗提供新的思路。