改良快速骨组织脱钙法在透射电镜样品制备中的应用

王立言，邴馨，刘尚明*，王辉，陈艳雯

（山东大学基础医学院实验核医学与电镜中心，济南 250012）

脱钙是制备骨组织透射电镜样品的第一步。然而，如何缩短脱钙时间，把握脱钙终点，减少脱钙过程中对组织的损伤，尽可能保持骨组织原有的微细结构，一直是研究人员密切关注的问题。传统的脱钙方法一般采用复合酸类脱钙液，其效果不稳定，对细胞及组织结构的破坏及对染色的影响，已不能满足透射电镜观察的要求[1,2]；EDTA脱钙的作用优于酸性脱钙液，但脱钙周期长，一般需要2-4周，不利于科研实验的进展。本方法通过大量实验，采用JYBL-Ⅱ组织脱钙液并在此基础上进行了改进，对骨组织脱钙后进行透射电镜样品制备，在电镜下观察取得良好效果，同时很大程度的降低了脱钙时间。

材料与方法

1 标本

取小鼠新鲜股骨组织，大小为1 mm×1 mm×3 mm。

2 试剂

改进的脱钙液为Leagene JYBL脱钙液、戊二醛及磷酸缓冲液按一定比例配制而成的混合液。具体配制方法如下：100 mL Leagene JYBL-Ⅱ脱钙液（北京雷根生物技术有限公司）、20 mL 25%戊二醛（SPI，美国）、40 ml 0.2 mol/L，pH7.4 磷酸缓冲液混合均匀，4℃冰箱保存。

3 实验方法

传统脱钙方法：将取好的骨组织入预冷的3%戊二醛中，4℃下固定2~4 h或更长。骨组织固定好后入缓冲、等渗、中性EDTA脱钙液中，4 ℃下振荡脱钙2~4周。

改良脱钙方法：将取好的骨组织立刻投入到3%戊二醛与4%多聚甲醛的混合液中，4 ℃固定12 h；0.1 mol/L、pH7.4磷酸缓冲液浸洗1 h（0~4℃）；弃去缓冲液，在小瓶中加入改进脱钙液对骨组织进行脱钙（4 ℃）。脱钙液要没过骨组织，约为骨组织体积的40倍；脱钙时间控制在24 h以内：每隔一段时间检测一次脱钙程度，在骨组织富有弹性、针刺无阻力感时即可终止脱钙。在保证超薄切片质量情况下，应尽量缩短脱钙时间，避免脱钙时间过长和反复针刺检测造成组织损伤。

两种方法脱钙结束后，均行常规透射电镜样品制备过程：0.1 mol/L、pH7.4磷酸缓冲液浸洗3 h，中间换液3次（0～4℃）；1%锇酸中后固定2 h（0～4℃）；0.1 mol/L、pH7.4磷酸缓冲液浸洗3 h，中间换液3次；依次在30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮中梯度脱水，每次15 min，其中100%丙酮脱水2次；在纯丙酮∶Epon 812包埋剂为3∶1、1∶1和1∶3的混合浸透液中分别浸透1 h、3 h和12 h后，在纯包埋剂中浸透12 h；用纯包埋剂再包埋模具中包埋；37 ℃和45 ℃各聚合2 h后，60 ℃聚合48 h；超薄切片机（剑桥，英国）切片、醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后行透射电镜（JEM-1200EX，日本电子）观察[3]。

结 果

透射电镜观察显示：用传统方法脱钙处理的样品其切片质量较差，骨细胞突起减少，胶原纤维、细胞核及细胞器均不清晰，骨细胞超微结构破坏较明显（图1A）；而用改良脱钙方法处理的样品其切片质量更好，超微结构更完整，骨陷窝内骨细胞清晰可见，骨细胞表面的突起保存完好，细胞核及胞质内的细胞器结构完整清晰，基质中的胶原原纤维在纵切面上可见明显的周期性横纹（图1B）。

讨 论

骨组织由细胞、纤维和基质构成，其中含有大量的无机盐。无机盐的主要成分为以羟基磷灰石结晶形式存在的磷酸钙和碳酸钙[4]，约占骨干重的70%。由于钙盐的沉积，骨组织非常坚硬。在透射电镜样品制备过程中，如果不去除骨组织的钙质，会给固定、脱水、浸透带来困难，也无法制作出有效的超薄切片。因此在样品制备前需要对骨组织进行有效脱钙，使钙盐溶解，使标本变软[5]，才能进行后续操作。

目前的脱钙液有有机酸、无机酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等多种。用酸类脱钙时，脱钙速度快，但对骨组织破坏明显，因此不适合透射电镜样品的制备。EDTA是一种相对较好的螯合脱钙剂，对组织结构影响较小，能保存组织中的抗原物质和某些酶的活性，但是EDTA 脱钙操作复杂，脱钙时间长（2~4周）。长时间的脱钙不利于脂类等物质的保存，也延长了实验周期[6-8]。经过大量的实践，我们改进了JYBL-Ⅱ组织脱钙液，在脱钙液中加入专用的戊二醛电镜固定剂，同时对戊二醛的浓度、渗透压、pH值等参数进行了精确调整，消除试剂间的相互作用，由此更适合于制备电镜样品[9]。该方法的特点是：①作用迅速，24 h即可完成脱钙；②固定和脱钙同时进行，更利于微细结构的保存。③脱钙完全。如果脱钙不完全，胶原原纤维上的无机盐结晶会使周期性横纹不可见。

本研究结果表明，应用后改良快速骨组织脱钙法制备透射电镜样品，可有效防止骨组织过度膨胀和脱钙对骨组织的损伤，脱钙时间由传统的2~4周缩短至24 h；骨组织超微结构保持完好，细胞及纤维形态结构清晰；脱钙液中的戊二醛可以较好的保存抗原活性[10]，脱钙后的骨组织可正常进行免疫组织化学和原位杂交组织化学染色；脱钙过程中无需更换脱钙液，操作简便，脱钙均匀，效果良好，在骨组织透射电镜样品制备中具有较高的应用价值。