9例46，XY完全性性腺发育不全患者分子遗传学分析

王海城，刘 宇，叶 荟，倪 琳，曹 英，孙云龙，肖 冰，马彩霞，唐利芳

1.上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所小儿内分泌与遗传代谢病研究室，上海 200092；2.复旦大学附属中山医院青浦分院儿科，上海 201700

性别发育分化包括染色体性别确定、性腺分化与形成及内外生殖管道的发育，以高度有序的组织特异性和时间依赖性的方式诱导性发育。任何影响性别决定和性别分化过程的基因缺陷都可能导致性发育障碍（disorders of sex development，DSD）。根据染色体核型，DSD可分为3种类型：46，XX DSD、46，XY DSD和性染色体DSD。其中46，XY DSD 患者临床表现异质性大，根据性腺分化异常的程度不同，分为46，XY完全性性腺发育不全（46，XY complete gonadal dysgenesis，46，XY CGD）和46，XY 部分性性腺发育不全（46，XY partial gonadal dysgenesis， 46，XY PGD）。46，XY CGD临床特征为女性表型，原发闭经，青春期乳房不发育，外生殖器幼稚，子宫、输卵管、阴道发育不良，无睾丸，正常苗勒管结构和条索状性腺［1］。目前已发现30余个DSD 相关基因，多由SRY、NR5A1（SF1）、SOX9、DHH、GATA4、WT1、ZFPM2、WWOX等基因突变，DMRT1、SF1、WT1的单拷贝基因表达或NR0B1、WNT4基因重复所致［2-4］。其中SRY、NR5A1基因突变在46，XY DSD 患者中各占10%～15%［5］，MAP3K1基因突变占10%～18%［6］。以往通过病史、激素水平、影像资料、染色体核型分析及对致病基因Sanger测序诊断DSD；但因发病机制尚不清楚，基因型与表型相关性较差，仅有20%的DSD患者可得到明确的分子诊断。随着染色体微阵列（chromosome microarray，CMA）和二代测序（next generation sequencing，NGS）等高通量分子诊断技术的发展，遗传病因不明的DSD 患者的诊断率大大提高。NGS 技术包括外显子组测序（whole exome sequencing， WES） 和靶向基因测序 （target sequencing，TS）等。WES 捕获蛋白质编码区的核苷酸序列，测序较全面；而TS捕获已知的特定基因或候选基因组区域的外显子、内含子和部分调控序列，基因覆盖范围较深，检测成本低。46，XY DSD 患者TS/WES测序的诊断率为35%～69%［2-3，7-9］。国内一项研究应用靶向基因Panel对87例46，XY DSD患者进行高通量基因测序，发现AR、NR5A1和SRD5A2基因突变较常见，比例分别为35.0%、21.7%和21.7%［10］。CMA的优势是可以检测到小而隐秘的拷贝数变异（copy number variations，CNVs）。一项研究应用靶向微阵列筛选了116 例46，XX 和46，XY DSD 患者，检测出21.5%的CNVs［11］。本研究对9例46，XY CGD 患者先行常规的SRY基因测序、染色体核型分析，在未发现SRY致病突变时进一步应用高通量的测序技术如CMA、WES或TS进行分析，以期更精确、全面了解患者发病的分子遗传病因。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2010—2017 年就诊于上海交通大学医学院附属新华医院遗传咨询门诊的9 例46，XY CGD 患者（P1～P9）的临床资料。患者的社会性别均为女性，具体临床表型见表1。本研究经上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会批准（XHEC-D-2021-186）。

1.2 检测方法

1.2.1 染色体核型分析 将新鲜的肝素抗凝外周血1 mL 加入到10 mL 含20% 小牛血清（Invitrogen Gibco，美国）的RPMI1640 培养基液中，置于5%二氧化碳培养箱（37 ℃）培养72 h，收获前1 h 加入终浓度为8×10-5g/L 的秋水仙素。收获中期淋巴细胞，依次进行低渗、固定、制片、胰酶处理、Giemsa 染色，光学显微镜［CX21，奥林巴斯（中国）有限公司，中国］下观察染色体G显带。制片后配置硝酸银溶液，Giemsa 染色，光学显微镜下观察N 显带。镜下分析50个染色体中期分裂相，镜下配对分析5个中期核型，核型描述按《人类细胞遗传学国际命名体制》（ISCN2009）。

1.2.2 DNA 提取和SRY测序 抽取先证者和父母EDTA 抗凝外周血。使用QIAampDNA Blood Mini 试剂盒（Qiagen，美国）按照标准步骤提取DNA。利用特异引物通过PCR 扩增SRY基因整个编码区［12］，扩增产物应用ABI （Applied BioSystem，美国）3700XL进行测序。

1.2.3 采用单核苷酸多态性阵列进行CNVs 分析 2个家族样本DNA 应用SNP 6.0 芯片（Affymetrix，美国）按照制作商提供的标准化流程进行拷贝数分析。采用Affymetrix CytoScanTM750k 芯片（Santa Clara，美国）分析2 例散发患者的CNVs。使用染色体分析软件（ChAS）1.2.2（Thermo Fisher Scientific，美国）分析样本的染色体CNVs。染色体位置信息参照GRCh 37/Hg19。

1.2.4 TS/WES 测序 本研究中使用的DSD Panel 的设计和操作标准参照相关文献［8］。共捕获并测序了2 972 个外显子，共219 个基因的1 078 042 个碱基。参照XIE 等［13］的方法进行靶向基因组捕获和NGS，参照SUN 等［14］的方法行WES 检测。结果显示：病例P2、P6 和P9 的SRY基因测序点突变阴性，未发现致病突变。对该3 例早期收集的散发患者，采用高通量TS筛查致病基因；后期收集的2例患者（P7和P8）在未检测到SRY致病突变后，应用WES 进行高通量检测。

1.2.5 生物信息学分析 高通量测序原始数据经质控、比对、去重等步骤，应用GATK （Version 3）（Broad Institute，美国）检测单核苷酸变异（single nucleotide variation， SNV） 和插入缺失标记（insertion-deletion，indel），将高频的变异［在千人基因组项目、人群基因组突变频率数据库（gnomAD）和Exome Variant Server（EVS）中频率＞1%或包含500 个外显子的当地数据库中频率＞5%］从候选的变异中过滤掉。候选突变经过逐级评估后，根据美国医学遗传学与基因组学学会（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南进行分类［15］。采用PhastCons软件对家族病例内含子的缺失片段进行保守区段分析并予以保守性计分。

2 结果

9 例46，XY CGD 先证者通过SRY基因测序，4 例患者（P1、P3、P4、P5）检测出明确SRY致病/疑似致病变异。其中2个为已知致病突变［NM_003140.1：c.264dup（P3）和NM_003140.1：c.169C＞T（P4）］，其余2 个为未见报道的致病/疑似致病突变［SRY缺失突变（P1）和NM_003140.1：c.208T＞C（P5）］。

NGS 测序发现P9 患者携带MAP3K1基因的NM_005921.1：c.1016G＞A 疑似致病突变。患者P6 因SRY基因测序点突变阴性，经Affymetrix CytoScan芯片检测未检出致病性CNVs；为进一步明确有无致病变异，采用TS 测序技术发现该患者携带HSD17B3基因的c.590T＞C 错义杂合突变，该突变临床意义不明。患者P2 经核型分析、DSD 常见致病基因测序未检出致病突变，进一步行NGS 检测未检出明确致病突变，芯片检测未检出明确致病性CNVs。

芯片检测发现2个家族病例（P7和P8）的DMRT1基因内含子2的片段缺失。该家系是一对46，XY CGD姐妹，其父母为近亲，其系谱如图1所示。首先对SRY基因编码区进行测序，未检测到任何突变。为进一步筛查疾病相关基因，对妹妹DNA 进行高通量WES，仍未发现已知基因的致病突变或可能与性发育相关的基因变异。遂采用SNP 6.0芯片对先证者和妹妹的基因组DNA 进行检测，发现9p24.3基因片段中DMRT1内含子2 中约14 kb 纯合缺失（Chr9：866，388-880，086，hg19），因纯合缺失范围大，考虑可能为疑似致病变异（图2）。对其缺失片段进一步验证，设计一组引物位于2 个断点外（F1-AGATCCGTTTGATTTTAGACAGC；R1-AGGGCCATCGTTTTAAACTCA），另一组包含末端缺失断点（F2-TTGTGCCCATACATTCAAGCC；R1-AGGGCCATCGTTTTAAACTCA），见图3。引物F1-R1 在2 个姐妹及其双亲中均扩增出700～800 bp 的基因片段（图4），而F2-R1 仅在双亲中扩增出800～900 bp 的基因片段（图5）。最后，对F1-R1 扩增产物测序，发现低拷贝重复区（low copy repeats，LCR）位于缺失片段的两侧，提示可能LCR介导的基因重排。应用PhastCons软件进一步对内含子2中缺失片段进行保守性分析，发现2个保守的非编码元件（conserved non-coding elements，CNEs）；最保守的CNE 的PhastCons LOD 得分为524，得分第二的CNE 的PhastCons LOD 得分为325。9 例CGD 患者的分子遗传学检测结果见表1。

表1 9例CGD患者的临床特征和分子遗传学检测结果Tab 1 Phenotypic description and genetic findings in 9 patients

Continued Tab

图1 两姐妹（P7和P8）先证者的家系谱Fig 1 Family pedigree of two sisters(P7 and P8)

图2 CMA检测出DMRT1内含子2中约14 kb纯合缺失Fig 2 An approximate 14 kb homozygous deletion in intron 2 of DMRT1 by CMA

图3 F1-R1和F2-R1扩增产物验证CMA结果Fig 3 Amplified products of F1-R1 and F2-R1 verify CMA result

图5 F2-R1仅在亲本中扩增出的800～900 bp基因片段Fig 5 800-900 bp product amplified by F2-R1 only in parents

3 讨论

本研究中，经过分子遗传学检测，9 例46，XY CGD 患者中，5 例获得了明确的分子遗传学病因诊断。有研究［9］表明表型严重的CGD 患者基因异常检出的频率较高。EGGERS 等［3］在24 例46，XY CGD患者中，共发现11例具有致病性变异。

在本次小样本分析中，SRY突变相对常见。我们在4例患者中发现了SRY基因致病/疑似致病变异。患者P1 确定为SRY缺失，患者P3 和P4 为SRY基因截短突变，患者P5 为SRY一个新的错义变异（NM_003140.1：c.208T＞C）。SRY是引发性腺发育成睾丸的最重要的性别决定基因［4］。在人类基因突变数据库中记录了100余种SRY突变，其中包括错义/无义插入缺失突变、小片段插入/缺失突变及大型片段插入/缺失突变。人类SRY编码区翻译204 个氨基酸，包含3 个功能区域：N-末端、中心域（DNA 结合结构域）和C-末端。中心结构域由编码高迁移率族蛋白（high mobility group，HMG） 的79 个氨基酸组成。在高度保守的HMG 盒已发现较多新发突变，同时在SRY的其他区域鉴别出小部分突变。在本研究中，病例P3、P4 和P5 突变涉及SRY基因关键的HMG 盒区，病例P1突变发生在SRY其他区域。

本研究中患者P6携带HSD17B3基因c.590T＞C 杂合突变，为一新发突变，位于外显子8，ACMG 评级为临床意义不明变异。HSD17B3基因位于人类染色体9q22，包含11 个外显子，编码17β-羟基类固醇脱氢酶3 （17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3，17β-HSD3）。该酶参与雄激素合成，是一种含有310 个氨基酸的微粒体酶，主要在睾丸中表达，在辅助因子的作用下转化为睾酮。17β-HSD3 缺乏症是由HSD17B3基因突变引起的46，XY DSD 的罕见常染色体隐性疾病。国内有一项研究［10］，在中国46，XY DSD 患者中检测到HSD17B3突变率为4.9%，相较英国、美国和土耳其人群突变率低。一项国内研究［16］在3 例46，XY DSD 患者中发现该基因2 个新发突变（c.852G＞A和c.124_127delTCTT）。本例样本仅检出1 处意义不明变异，根据隐性遗传规律，这一杂合突变无法解释患者的表型。

患者P9 经基因检测发现1 个既往报道过的MAP3K1基因外显子4 的突变位点c.1016G＞A （p.Arg339Gln）［2］。MAP3K1是一个信号转导因子，是调控睾丸特异性发育的转录因子和信号蛋白网络的关键成分［6］。MAP3K1突变所致临床表现有很大的异质性，包括从CGD 到尿道下裂的多种表型［2-3，17］。回顾以往报道的MAP3K1突变病例，10%～18%的46，XY DSD 患者由MAP3K1致病突变引起，尤其是46，XY CGD 或46，XY PGD 个体；MAP3K1致病突变是导致完全或部分性腺发育异常的46，XY DSD 最常见的原因之一［6］。

P7 和P8 两姐妹检出9p24.3 上同一片段缺失。目前，尚未见此片段缺失的文献报道。9p 缺失综合征的性别反转候选区域已缩小到9p24.3 区域，且DMRT1和DMRT3为主要的候选基因［18］。DMRT1是决定性别和性发育的关键基因之一，其编码具有锌指DNA 结合区域的男性特定转录因子。LEDIG等［19］在1 例46，XY DSD 两性畸形的女性患者中检测到约35 kb 的片段缺失，该缺失突变为影响DMRT1基因外显子3 和4 的最小缺失，表明单独DMRT1突变足以引起XY DSD。MELLO 等［20］报道了1 例XY 部分性腺发育不良患者的DMRT13'UTR中存在一个核苷酸插入突变，因此推测DMRT1非编码区可能存在的未检测到的突变改变了DMRT1的表达。近年来，多项研究表明，多种疾病相关基因的内含子突变可影响信使mRNA 剪接［21-22］；若缺失区域包含保守区域，也可影响基因的表达［23］。为寻找14 kb 区域内的保守片段，本研究采用UCSC基因组浏览器提供的PhastCons 软件，其对于保守片段的出现更敏感。在MULTIZ 创建的多个脊椎动物基因组序列中进行比对后发现的2 个CNEs，LOD 得分较高，序列保守性强，因此推测，患者DMRT1内含子2 的突变可能会影响DMRT1的表达。然而，因缺失片段（约14 kb）太大，无法预测潜在的剪接元件或转录因子结合位点，而这些位点在功能上有重要作用。遗憾的是，我们没有取得患者的组织来检测DMRT1的表达。DMRT1非编码区的变异可能是该家族的致病候选基因，但没有进一步的证据支持这一假设。

本研究表明SRY突变为46，XY CGD 较常见的原因，逐步分析46，XY CGD 患者的遗传病因有助于全面了解46，XY CGD 患者的分子病因，从而可为临床咨询和决策提供依据。