葛根素对妊娠期糖尿病大鼠的治疗效果及作用机制的研究*

杨根岭 胡荣静 李金艳△

（1.重庆医科大学，重庆 400016；2.重庆市中医院，重庆 400021）

妊娠期糖尿病（GDM）是一种常见妊娠期并发症［1］，GDM时妊娠不良结局增加［2］。胰岛素治疗GDM时会引起胰岛素敏感性降低［3］。细胞摄取葡萄糖是维持正常血糖的关键步骤，膜蛋白（GLUT）转运葡萄糖到细胞质是完成胰岛素信号通路的最终步骤［4］。葛根素（Puerarin）是从葛根中提取出的最主要异黄酮类物质［5］，能改善高血糖导致的机体发生的病理改变，具有良好的降糖效果［6］。许多口服降糖药物对胎儿有致畸作用［7］。目前，国外尚未开展葛根素治疗GDM方面的研究，国内有少数学者将葛根素应用于临床治疗GDM。该试验研究葛根素对GDM的降糖效果，并探讨葛根素在治疗GDM时的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 PF级SD大鼠雌性50只，雄性20只，购于重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（渝）2018-0003。

1.2 试药与仪器 葛根素注射液，购自山东方明药业集团股份有限公司，批号20111071，规格为0.1 g/支。仪器：光学显微镜（日本Nikon公司），欧姆龙HEA-214血糖仪，酶标仪（ThermoFisher）。

1.3 模型制备 SD大鼠尾静脉采血测定雌鼠空腹血糖，若血糖大于7.1 mmol/L，予以剔除。动物合笼，次日阴道涂片确定妊娠后按35 mg/kg腹腔注射2%链脲菌素（STZ）。检测血糖≥13.8 mmol/L视妊娠期糖尿病SD大鼠造模成功。

1.4 分组与给药 将成模大鼠随机分为葛根素组与糖尿病组，正常妊娠SD大鼠作为对照（正常妊娠组），每组各10只。建模成功后4～20 d，葛根素组每天给予150 mg/kg葛根素灌胃治疗［8］，糖尿病组与正常妊娠组灌胃等量生理盐水。

1.5 观察指标 每天检测孕鼠的血糖，妊娠1、11、20 d测体质量，妊娠20 d剖宫取胎鼠，记录胎鼠的数量、畸形发生数。

1.6 标本采集与检测 1）胰岛素及血脂水平检测。在20 d眶静脉采血，经离心后收集血浆。采用ELISA试剂盒检测血浆胰岛素水平。BS800-2迈瑞全自动生化分析仪测定血清中高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TAG）的含量。2）胰岛素病理学观察。HE染色：在G20.5乙醚麻醉下行剖宫产术，取孕鼠胰腺组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。胰腺组织切片经脱蜡、覆水、苏木精染色、返蓝、盐酸酒精分化、伊红复染、脱水、透明、封片，镜检。3）胰腺GLUT-4蛋白表达。胰腺组织切片经脱蜡复水，抗原修复，去除内源性过氧化氢酶，血清封闭，加GLUT-4（浓度为1∶100）过夜，加抗兔生物素化二抗，显色。苏木素复染，盐酸酒精分化，饱和碳酸锂返蓝，脱水、透明、封片、镜检。4）Western blotting检测GLUT-4蛋白表达。提取胰腺组织蛋白，经电泳分离、电转至PVDF膜、封闭PVDF膜、分别孵育GLUT-4、β-actin一抗（1∶1 000）4℃过夜，孵育二抗，Bio-Rad凝胶成像系统软件成像及分析目的条带和内参条带的灰度值。

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。数据以（）表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组孕鼠随机血糖水平比较 见表1。糖尿病组与葛根素组孕鼠的血糖显著高于正常妊娠组，有显著统计学意义（P＜0.05）。葛根素不能将孕鼠的血糖完全降至正常，但随着给药时间的延长，降糖效果逐渐明显，在7 d后葛根素组血糖明显低于糖尿病组（P＜0.05）。

表1 各组孕鼠随机血糖水平比较（mmol/L，±s）

表1 各组孕鼠随机血糖水平比较（mmol/L，±s）

注：与糖尿病组比较，*P＜0.05；与正常妊娠组比较，△P＜0.05。下同。

组别正常妊娠组糖尿病组葛根素组n 10 10 10 1 d 4.30±0.60 4.61±0.58 4.80±0.41 4d 4.50±0.70 26.23±2.83△27.50±3.03△7d 4.40±0.90 27.62±3.66△24.30±5.36*△10d 4.60±0.80 26.82±4.59△18.42±4.72*△13d 4.80±0.60 28.43±5.61△15.48±5.26*△16d 4.90±0.80 31.52±3.68△13.20±4.96*△19d 5.20±0.80 32.96±3.97△10.83±3.76*△

2.2 各组孕鼠血脂和胰岛素水平比较 见表2。与正常妊娠组比较，糖尿病组孕鼠的胰岛素水平下降、血脂显著增加（P＜0.05），给予葛根素治疗后，胰岛素水平显著增加、血脂水平显著降低，葛根素组与糖尿病组比较差异显著（P＜0.05）。葛根素组的胰岛素水平较糖尿病组显著升高，但显著低于正常妊娠组（P＜0.05），血脂水平显著低于正常妊娠组（P＜0.05）。

表2 两组各组孕鼠血脂和胰岛素水平比较（±s）

表2 两组各组孕鼠血脂和胰岛素水平比较（±s）

组 别n TC（mmol/L）TAG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）INS（mU/L）10 10 10正常妊娠组糖尿病组葛根素组1.91±0.42 5.43±1.56△3.32±1.25*△0.86±0.25 3.86±0.91△2.33±0.32*△2.48±0.43 5.01±0.81△3.25±0.57*△0.36±0.12 1.86±0.49△0.68±0.31*△16.38±3.16 9.36±1.48△13.20±4.52*△

2.3 各组孕鼠不同妊娠天数体质量比较 见表3。随着孕周的增加各组大鼠体质量均呈上升趋势。与正常妊娠组孕中期（11 d）与孕晚期（20 d）体质量相比较，糖尿病组孕鼠体质量均显著增加（P＜0.05）；葛根素组孕鼠体质量均无显著差异（P＞0.05）。与糖尿病组孕中期（11 d）与孕晚期（20 d）孕鼠体质量相比较，葛根素组体质量显著降低（P＜0.05）。

表3 各组孕鼠不同妊娠天数体质量比较（g，±s）

表3 各组孕鼠不同妊娠天数体质量比较（g，±s）

组 别n 妊娠1 d 妊娠11 d 妊娠20 d 234.1±12.3 236.6±13.2 230.1±18.4正常妊娠组糖尿病组葛根素组10 10 10 246.3±16.8 274.6±18.6△255.3±19.4*296.9±22.3 355.8±24.6△319.6±16.2*

2.4 各组胎仔数、胎鼠体质量、胎鼠血糖的比较 见表4。各组胎鼠均未发现有畸形发生。与正常妊娠组比较，糖尿病组与葛根素组胎仔数量显著减少，胎鼠体质量与血糖水平显著增加（P＜0.05）。与糖尿病组比较，葛根素组胎仔数显著增加，胎鼠体质量显著增加，胎鼠血糖显著降低（P＜0.05）。

表4 各组胎仔数、胎鼠体质量及血糖比较（±s）

表4 各组胎仔数、胎鼠体质量及血糖比较（±s）

组别正常妊娠组糖尿病组葛根素组n 10 10 10胎仔数（个）12.70±1.49 8.10±1.96△10.80±2.56*体质量（g）1.92±0.25 2.94±0.41△2.23±0.37*随机血糖（mmol/L）3.84±1.53 29.57±1.49△12.83±4.23*△

2.5 各组孕鼠胰腺组织病理学观察 正常妊娠组孕鼠胰腺胰岛形态结构正常，胰岛内的胰岛细胞排列均匀。糖尿病组胰岛萎缩，数量减少，体积变小，形状不规则，胰岛细胞呈虫噬状。葛根素组胰岛数量和体积均明显恢复，胰岛内胰岛细胞增多、纤维组织减少。见图1。

2.6 各组孕鼠胰腺组织GLUT-4免疫组化表达比较 GLUT-4主要表达在胰腺的胰岛内。镜下观察到，糖尿病组仅有少量的胰岛细胞染色为棕黄色，GLUT-4表达明显减少，低于正常妊娠组；经葛根素治疗后，胰岛的GLUT-4的表达明显增加，高于模型组。见图2。

2.7 各组孕鼠胰腺组织GLUT-4的表达水平 经Western blotting检测糖尿病组胰腺组织中GLUT-4蛋白相对表达量明显低于正常妊娠组（P＜0.05），葛根素组表达量明显升高，但仍然低于正常妊娠组（P＜0.05）。见图3。

图3 各组GLUT-4蛋白在胰腺组织的表达

3 讨 论

GDM是产科常见的并发症，在妊娠晚期容易出现急性羊水过多、胎盘早剥等急症［9］；新生儿容易出现呼吸窘迫综合征、死亡等急症。尽管胰岛素是治疗GDM的一线药物，但易出现低血糖等急症。中药在治疗许多疾病上有独特的作用［10］，为更好治疗妊娠期糖尿病，提高母儿预后，本研究重点研究葛根素应用于治疗GDM的效果及作用机制。

葛根素是天然异黄酮，现代医药已将其用于治疗糖尿病［6］。葛根素能改善高血糖导致的机体发生的病理改变，能促进处于高糖环境的前脂肪细胞对葡萄糖的摄取并呈剂量依赖性［11］。国内部分学者应用葛根素治疗GDM，降糖效果理想［12］，安全性高［13］，能降低胎儿脐动脉S/D值［14］，降低新生儿生长受限等并发症［15］。

妊娠时激素水平升高，胰岛素敏感性下降，出现胰岛素抵抗，导致GDM发生［16］。葛根素具有抗糖尿病的特性。葛根素能降低STZ诱导后小鼠糖尿病的发生，同时增加胰岛β细胞的数量，进一步增加胰岛素水平，降低血糖［17］。本研究发现GDM大鼠胰岛受到破坏后，胰岛素的生成急剧降低，而使用葛根素治疗后胰腺的胰岛细胞得以修复，胰岛细胞数量增加，胰岛体积变大，胰岛内纤维化明显缓解。葛根素对破坏的胰岛具有保护作用，并能进一步促进胰岛分泌胰岛素，该结果与国内外研究葛根素在治疗糖尿病时对胰岛的作用是一致的。同时研究发现葛根素在治疗GDM时，不能将胰岛素、血糖、血脂水平恢复至完全正常，但葛根素治疗GDM时能降低孕鼠及胎鼠的血糖水平，并能有效阻止血脂的升高，降低血脂水平，改善GDM孕鼠的代谢能力，能减少孕鼠和胎鼠体质量的增加，将孕鼠及胎鼠体重恢复至正常。同时葛根素能减少孕鼠的流产率，增加胎仔数，推测葛根素在胚胎着床时具有较强的保护作用。

GLUT有多种亚型，其中GLUT-1、GLUT-4对葡萄糖转运尤为重要［18］。GLUT-4在脂肪组织、心肌和胎盘组织中均有表达［19］。90%GLUT4位于细胞内；血糖增高时，GLUT4储存囊泡吸收葡萄糖向质膜、骨骼肌细胞的肌膜和T管进行胞吐，参与葡萄糖转运功能［4］。提高GLUT-4表达和刺激GLUT-4囊泡向质膜转运能促进葡萄糖转运［20］。本研究显示GLUT-4蛋白水平在GDM患者胰腺组织中明显减少，可能导致葡萄糖的摄取和利用出现障碍，进而不能维持正常的血糖水平；而使用葛根素治疗后GLUT-4蛋白的表达显著提高，表明其能促进葡萄糖的摄取和利用，具有降糖的作用。

该研究表明在治疗GDM时，葛根素对胰腺β细胞具有保护作用能恢复胰岛的数量，促进胰岛素的分泌；促进胰岛上GLUT-4的表达，促进葡萄糖的摄取和利用，从而降低血糖水平。葛根素能减少流产的发生，降低孕鼠及胎鼠的体质量，改善妊娠的结局。因葛根素不能将GDM血糖降至完全正常，但是其具有保护胰腺、促进胰岛素分泌作用，在治疗GDM时加用葛根素能取得更好的临床治疗效果。该课题为葛根素的使用提供实验室依据并能更好地指导中医师使用葛根素治疗临床疾病，开发葛根素临床治疗的新领域。