连花解毒合剂解热、抗炎、止咳及祛痰作用的实验研究

叶晓楠，朱路文，亢玉莹，梁润昱，王琳晶，李书霖，王有鹏，唐强*

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第四医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

新型冠状病毒肺炎，简称“新冠肺炎”，WHO将其命名为2019冠状病毒病（coronavirus disease 2019,COVⅠD‑19），其病原体为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS‑CoV‑2）[1]。其早期临床症状以发热、干咳、乏力为主要表现，少数患者可伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状，临床分为轻型、普通型、重型、危重型。经呼吸道飞沫和密切接触传播是其主要传播途径[2‑3]。连花解毒合剂是我院专家组根据国家卫健委、国家中医药管理局《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》（试行第三版）及《黑龙江省新型冠状病毒感染的肺炎中医药防治方案（试行）》，探讨并制定的新型冠状病毒肺炎的中医预防方案（院内协定方），该方由连翘、金银花、白术、佩兰、桑叶、桔梗和甘草[4‑5]7味中药组成，具有清热解毒、健脾化湿、宣肺利咽的功效，用于风热、湿热类的温病所致的发热头痛、咳嗽痰多、咽喉肿痛、气短、动辄汗出者。在疫情期间，广泛应用于临床上的中青年人群，具有良好的临床基础，目前正在将其开发成院内制剂。为了进一步明确连花解毒合剂的药理作用，本文进行了连花解毒合剂的解热、抗炎、止咳以及祛痰作用的研究[6‑8]，为连花解毒合剂的进一步研制及临床应用奠定实验基础。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016‑0006；SPF级ⅠCR小鼠，购自辽宁长生实验动物技术股份有限公司，生产许可证号：SCXK（辽）2020‑0001。饲养环境：温度23~25℃，湿度55%~65%，人工光照12 h∶12 h明暗交替。实验期间，动物自由饮食与饮水。

1.2 药物与试剂

连花解毒合剂（由黑龙江中医药大学附属第二医院制剂室提供，批号：20200722），每1.0 mL合剂相当于生药0.5 g；阿司匹林泡腾片（阿斯利康，批号：1905213）；氢溴酸右美沙芬片（石家庄以岭药业股份有限公司，A1910011）；高活性干酵母（安琪酵母有限公司，批号：20200418）；碳酸氢钠（天津市致远化学试剂有限公司，批号：201909）；苯酚红（天津市天新精细化工开发中心，批号：20191211）；氯化铵（天津市天力化学试剂有限公司，批号20200122）；二甲苯（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20190505）；氨水（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号：20191215）；凡士林（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20190101）。

1.3 主要仪器

FA2004分析天平（SOPTOP/舜宇恒平仪器）；TGL‑16E台式高速冷冻离心机（YⅠNGTAⅠ）；电热恒温水浴锅（天津天泰仪器有限公司）；Synergy MX型酶标仪（BⅠO TEK公司）；YP5002电子天平（常州市衡正电子仪器有限公司）；LY‑301C电子体温计（北京绿源恒泰医疗器械有限公司）。

2 方法

2.1 解热作用：酵母致大鼠发热实验

Wistar大鼠，体质量180~200 g，雌雄各半，适应环境3 d，于第4天起，每天早晚2次对大鼠实行适应性测量肛温，测量前用凡士林涂抹于大鼠肛门周围，待大鼠排空粪便后将体温计插入大鼠肛门，保持每次插入深度一致，连续测量3 d，2次/d，筛选出体温波动不超过0.5℃，平均体温在36.6~38.3℃的动物作为实验对象。正式实验前禁食不禁水12 h，实验当日上午每隔1 h测体温1次，连续测2次，取平均值为基础体温。随机抽取雌雄大鼠各5只大鼠作为空白对照组，除空白对照组外，其他组均背部皮下注射20%干酵母悬液10 mL/kg，空白对照组背部皮下注射等体积的生理盐水[9‑13]。致热6 h后，选取体温升高0.8℃以上的50只大鼠，将雌雄动物各随机分为连花解毒合剂低、中、高剂量组（1.8、3.6、7.2 g/kg）、模型组、阿司匹林组（阳性药组，0.2 g/kg），每组10只（雌雄各半）。各给药组灌胃给予相应的药物，空白对照组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水。分别于给药后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h测定记录各组大鼠体温。按公式计算各组大鼠在各时间点的体温升温值ΔT。

2.2 抗炎作用：二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验

雄性ⅠCR小鼠50只，体质量18~20 g，适应环境3 d，按体质量随机分为连花解毒合剂低、中、高剂量组（2.6、5.2、10.4 g/kg）、模型组、阳性药组（阿司匹林，0.2 g/kg），每组10只。每天灌胃给药1次，连续7 d，模型组给予等体积蒸馏水。正式试验前禁食不禁水12 h，末次给药0.5 h后，取二甲苯50μL均匀涂于小鼠右耳廓内外，0.5 h后将小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下2耳，用直径8 mm打孔器分别在同一部位打下双耳片，精密称质量，以两耳片质量之差作为肿胀度[14‑17]，并按公式计算肿胀度抑制率（%）。肿胀度抑制率=

2.3 止咳作用：浓氨水引咳实验

ⅠCR小鼠50只，体质量18~20 g，雌雄各半，适应

环境3 d，实验动物分组及给药方式同“2.2”，仅阳性药组小鼠改为灌胃给予氢溴酸右美沙芬（18 mg/kg），连续给药7 d。末次给药前禁食不禁水12 h，末次给药0.5 h后，进行浓氨水引咳，将小鼠放入倒置于桌面的500 mL玻璃钟罩内，用移液枪将0.5 mL浓氨水（25%氢氧化铵）滴于棉球上（100±5）mg，置于钟罩内引咳30 s后立即取出，观察小鼠的咳嗽反射（腹肌收缩，张大嘴，有时有咳嗽声），记录从放入小鼠到小鼠发生咳嗽反射的时间即咳嗽潜伏期和2 min内小鼠的咳嗽次数，并按公式计算咳嗽抑制率[18‑20]。

咳嗽抑制率=

2.4 祛痰作用：小鼠气管酚红排泄实验

ⅠCR小鼠50只，体质量18~20 g，雌雄各半，适应环境3 d，实验动物分组及给药方式同“2.2”，仅阳性药组小鼠改为灌胃给予氯化铵（1 g/kg），连续给药7 d。末次给药前禁食不禁水16 h，末次给药0.5 h后，腹腔注射2.5%酚红生理盐水溶液0.2 mL/10 g，注射0.5 h后，颈椎脱臼处死动物，仰位固定，颈部拉直，解剖分离出气管，剪下自甲状软骨至气管分支处的一段相同长度的气管，放入盛有2 mL 5%的NaHCO3的试管中，超声30 min，2 000 r/min离心5min，取上清液，用酶标仪于546 nm处测定吸光度（A）值[21‑25]。

2.5 统计学方法

采用SPSS25.0统计学软件进行数据分析，实验数据均以表示。采用单因素方差分析比较各组间、组内差异，方差齐者用LSD‑t检验比较两两之间差异，不齐者则用Tamhane'sT2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 连花解毒合剂对酵母致大鼠发热的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠在致热6 h后，体温显著升高（P＜0.01），升温约1.27℃，提示大鼠发热模型建立成功。与模型组相比，给药后各时间点，阿司匹林和连花解毒合剂高剂量组大鼠的ΔT值均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），连花解毒合剂中、低剂量组大鼠的ΔT值分别在在给药后2~5 h显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 连花解毒合剂对酵母所致大鼠发热的影响Table 1 Effect of Lianhuajiedu mixture on yeast‑induced fever in rats （±s，n=10）

表1 连花解毒合剂对酵母所致大鼠发热的影响Table 1 Effect of Lianhuajiedu mixture on yeast‑induced fever in rats （±s，n=10）

与空白对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

?

3.2 连花解毒合剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

与模型组相比，阳性药组（阿司匹林）、连花解毒合剂中、高剂量组小鼠耳肿胀度显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。阳性药组小鼠的肿胀度抑制率为61.43%，连花解毒合剂低、中、高剂量组小鼠的肿胀度抑制率分别为13.21%、24.64%、36.64%，见图1。

图1 连花解毒合剂对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响Figure1 Effect of Lianhuajiedu mixture on ear swelling in mice(±s,n=10)

3.3 连花解毒合剂对浓氨水致咳小鼠的影响

与模型组比较，阳性药组（氢溴酸右美沙芬）和高剂量的连花解毒合剂对小鼠咳嗽的潜伏期有显著的延长作用（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，阳性药组、连花解毒合剂各剂量组小鼠2 min内咳嗽次数显著减少（P＜0.05或P＜0.01），且各剂量组呈现较好的量效关系。阳性药组小鼠的咳嗽抑制率为50.55%，连花解毒合剂低、中、高剂量组小鼠的咳嗽抑制率分别为24.18%、32.97%、和37.36%，见图2。

3.4 连花解毒合剂对小鼠气管酚红排泌量的影响

与模型组相比，阳性药组（氯化铵）、连花解毒合剂中、高剂量组小鼠气管酚红排泌量明显增加（P＜0.05或P＜0.01），连花解毒合剂低剂量组小鼠气管酚红排泌量也有增加的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 连花解毒合剂对小鼠气管酚红排泌量的影响Figure 3 Effect of Lianhuajiedu mixture on excretion of phenol red in mice(±s,n=10)

4 讨论

《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》将新冠肺炎归属于“疫”病范畴。“疫”病是古代医学对烈性传染病的总称。专家对新冠肺炎感染者的临床特点分析指出：患病者症状出现频率较高的是发热、倦怠乏力、干咳、纳呆、口干、腹泻等，基本符合中医学中疫病的临床特点[26‑27]。连花解毒合剂为我院院内协定方，该方以抗邪气、祛疫浊为主略兼调畅气机为总旨，功能清热解毒、健脾化湿、宣肺利咽。本研究结果表明，在酵母致大鼠发热模型中，连花解毒合剂高剂量组在给药后1~5 h，大鼠体温均显著下降，降温作用持续时间较长；连花解毒合剂低剂量组在给药后2 h，与模型组相比，体温显著降低，但持续时间较短。发热与炎症密切相关，且炎症表现可能参与外感及肺炎症状的全过程[28]。本研究在确定了连花解毒合剂具有解热作用的基础上，进行了二甲苯致小鼠耳肿胀实验，结果表明，连花解毒合剂中、高剂量组与模型组相比，肿胀度显著降低，表现出良好的抗炎效果。在小鼠气管酚红排泌实验中，连花解毒合剂中、高剂量组与模型组相比，小鼠气管酚红排泌量显著增加，提示本药具有较好的祛痰作用。此外，在小鼠浓氨水引咳实验中，连花解毒合剂低、中、高剂量组小鼠咳嗽次数显著减少，且高剂量组小鼠的咳嗽潜伏期显著缩短，表明连花解毒合剂有良好的止咳效果。

综上所述，连花解毒合剂具有明显的解热、抗炎、止咳以及祛痰作用。本研究为连花解毒合剂的功效主治提供了实验依据和科学阐释，但其药理作用机制尚待进一步研究。