RSK信号通路抑制剂联合阿奇霉素在沙眼衣原体感染小鼠模型中的作用研究

董凯凯，陈丹丹，朱迎春，张晶晶，葛建彬

（南通市第二人民医院药剂科，江苏 南通 226000）

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,CT）是具有特定生命周期的一种细胞内寄生病原菌，可通过性传播疾病引发一系列泌尿生殖道疾病，如：女性宫颈炎、盆腔炎、不孕症等[1]。CT感染已发展成为全球公共卫生问题之一，其患病率呈逐年上升趋势，对人们身体健康产生极大威胁[2]。当前，临床多推荐采用抗生素治疗CT感染，首选药物为大环内酯类抗生素如阿奇霉素、多西环素等，但临床实践显示抗生素治疗CT感染效果不佳，失败案例常有报道[3]。因此，积极探索新方法或新药物治疗CT感染，已成为临床亟待解决的重要问题之一。

近年来，宿主导向疗法作为微生物感染治疗的新方向成为国内外研究的热点。宿主导向疗法主要通过调节宿主自身作用机制以干扰病原体持续复制或增强宿主免疫反应发挥治疗效果，通常作为常规药物抗感染治疗的辅助治疗手段。宿主导向疗法已在传染性疾病和真菌感染治疗方面取得了一定进展，但在衣原体感染治疗方面研究报道较少[4‑6]。Rother等[7]研究证实抑制肌醇‑5′‑单 磷 酸脱 氢酶（inositol‑5′‑monophosphate dehydrogenase,ⅠMPDH）作用位点能够有效抑制体内外衣原体生长，表明ⅠMPDH可能是衣原体宿主导向疗法的新靶点，为衣原体宿主导向疗法奠定了实验基础。既往研究表明[8]，CT的生长依赖于促分裂原活化蛋白激酶（mitogen‑activated protein kinase,MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）激酶（MEK）/ERK信号通路作用，通过MEK抑制剂U0126作用可减少CT包涵体形成单位（inclusion forming unit,ⅠFU），提示MEK抑制剂U0126对CT感染具有抑制作用。核糖体S6蛋白激酶（ribosomal S6 kinase,RSK）是MAPK/ERK信号通路下游重要的效应分子之一，薛耀华[9]研究报道RSK抑制剂LJⅠ308能够显著抑制CT体外感染，且在CT体外感染中，LJⅠ308与阿奇霉素联合应用起协同效果。本研究在此基础上探究RSK信号通路抑制剂LJⅠ308联合阿奇霉素在CT感染的体内作用，以期为临床治疗CT感染提供新方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Balb/c雌性小鼠80只，6~8周龄，体质量18~24 g，购于南通大学实验动物中心，生产许可证号SCXK（苏）2019‑0001。

1.2 主要试剂和仪器

主要试剂：E型CT菌株（中国医学科学院皮肤病研究所惠赠）；人宫颈癌上皮细胞株（Hela‑229，中国医学科学院基础医学研究所细胞中心）；醋酸甲羟孕酮注射液（Pfizer Manufacturing Belgium NV，批准文号：H20050057，规格：3 mL∶0.15 g）；阿奇霉素（华北制药集团制剂有限公司，批准文号：H20066581，规格：0.25 g）；放线菌酮（美国Gibco公司）；HE染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；蔗糖‑磷酸盐‑谷氨酸盐溶液（sucrose‑phosphate‑glu‐tamate,SPG）无菌溶液（北京雷根生物技术有限公司）；DEME培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（广州蕊特生物制品有限公司）；荧光标记的衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体（爱尔兰Trinity公司）；DAPⅠ（美国Ⅰnvitrogen公司）；RSK抑制剂LJⅠ308（美国MCE公司）；兔抗人RSK、p‑RSK单克隆抗体、鼠抗人 甘 油 醛‑3‑磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde‑3‑phos‐phate dehydrogenase,GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的山羊抗兔ⅠgG抗体、山羊抗鼠ⅠgG抗体（美国Abcam公司）。

主要仪器：MCO‑18AⅠC型CO2恒温培养箱（日本SANYO公司）；5430R高速低温离心机（德国艾本德公司）；FCK‑50C荧光显微镜（日本Olympus公司）；680型酶标仪（美国Bio‑Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 CT感染液的制备 用E型CT菌株感染Hela‑229细胞，在含有10%（φ）胎牛血清和1μg/mL放线菌酮的DEME培养基中培养，收集单层感染Hela‑229细胞，胰酶消化后反复冻融3次，4℃下以1 500 r/min离心10 min沉淀细胞碎片，收集上清液，在4℃15 000 r/min离心条件下离心60 min，离心后的沉淀物即为纯化的CT，将其悬浮于SPG溶液中，计算确定ⅠFU，取1×106ⅠFU/mL作为接种剂量，按每份0.5 mL分装保存于-70℃冰箱备用。

1.3.2 CT感染小鼠模型建立 80只Balb/c雌性小鼠适应性饲养1周，腹部皮下注射醋酸甲羟孕酮注射液2.5 mg/只，1次/周，连续注射2周后，随机抽取64只小鼠阴道接种CT感染液：每只小鼠腹腔注射20%（ρ）乌拉坦0.1 mL，观察小鼠麻醉至安静且呼吸稳定后，将湿棉签插入小鼠阴道旋转几次擦去分泌物，取小儿头皮针软管约2 cm连接1 mL无菌注射器，软管前端送入小鼠阴道约0.8~1 cm深度，推入CT感染液（1×106ⅠFU/mL SPG悬液）50μL，接种后小鼠倒置位15 min，促使感染液充分进入小鼠阴道内。

1.3.3 动物分组与给药处理 阴道接种CT感染液的64只小鼠以随机数字表法分为4组，分别为感染组、LJⅠ308组、阿奇霉素组、LJⅠ308联合阿奇霉素组，每组16只；未进行阴道接种CT感染液的16只小鼠设为空白对照组。感染后第3天，LJⅠ308组小鼠灌胃给药LJⅠ308 60 mg/kg，阿奇霉素组小鼠灌胃给药阿奇霉素2 mg/kg，LJⅠ308联合阿奇霉素组小鼠灌胃给药LJⅠ308 60 mg/kg和阿奇霉素2 mg/kg，空白对照组和感染组小鼠灌胃给予同等剂量的SPG无菌溶液。分别于感染后第4天、7天、14天、21天、28天，将干燥的一次性无菌采样拭子插入小鼠阴道约0.8~1.0 cm深度，顺时针转动10圈后取出，剪断采样拭子头部，置入EP管中（含SPG溶液1 mL，冰上保存），做好标记后室温下混匀，棉拭子在管壁充分挤压释放水分，每份阴道分泌液标本分装后置于-70℃冰箱备用。每组小鼠在给药后第28天（取完阴道拭子标本后）用断颈方法处死，取小鼠生殖道组织进行相应检查。

1.3.4 各组小鼠CT感染阳性率和衣原体数量检测 分别取上述各组小鼠阴道分泌液标本50μL接种于Hela‑229单层细胞96孔培养板中（每个样品分别接种2份），培养板在1 800 r/min条件下离心60 min，37℃摇床摇动30 min，移去接种物，200μL细胞培养液（含10%胎牛血清，1μg/mL放线菌酮）冲洗后加入500μL CT培养液，置入10 mm爬片，37℃，5%（φ）CO2培养箱中孵育24 h，进行直接免疫荧光染色。弃去培养板中的细胞培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗细胞2次，4%（φ）多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2次，用0.5%Triton‑100作用于细胞15 min，PBS洗涤2次，从培养板内取出爬片，加入荧光标记的衣原体主要外膜蛋白单克隆抗体（PBS按1∶100稀释），37℃培养箱中孵育30 min，PBS洗去抗体，DAPⅠ染色10 min，PBS漂洗爬片2次，干燥后封片剂封片，荧光显微镜下观察，有CT包涵体生长记为阳性感染。随机选取10个200倍视野统计包涵体数目，并根据其稀释浓度计算各组感染小鼠包涵体数量，结果以对数表示。

1.3.5 各组小鼠生殖道组织病理学检查 将各组小鼠生殖系统标本置入10%（φ）甲醛溶液中固定24 h，经脱水、石蜡包埋后，制备切片，将切好的石蜡切片分别用二甲苯Ⅰ液脱蜡10 min、二甲苯Ⅱ液脱蜡5 min，无水乙醇处理1 min（共2次），85%（φ）乙醇5 min，蒸馏水5 min，用苏木精染色3 min，蒸馏水洗10 min，1%盐酸乙醇分化30 s、蒸馏水洗1 min，1%稀氨水反蓝30 s、蒸馏水洗1 min，0.5%伊红液染色5 min，蒸馏水洗30 s，85%乙醇和95%乙醇分别脱水2 min，无水乙醇处理2 min，二甲苯Ⅰ液透明2 min、二甲苯Ⅱ液透明2 min，中性树胶封片，在光镜下观察各组小鼠生殖道组织病理学变化情况。

1.3.6 Western blot法检测小鼠生殖道组织中RSK信号通路相关蛋白表达水平 收集各组小鼠生殖道组织标本，加入组织裂解液，提取组织总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度，取定量蛋白经SDS‑PAGE分离，并将分离所得蛋白电转移至PVDF膜，用含0.5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温下封闭膜1 h。分别加入RSK（1∶800）、p‑RSK（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗与PVDF膜共同孵育，4℃过夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入对应HRP标记的二抗（1∶2 000），室温下与PVDF膜共同孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL发光液进行显影，分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值之比表示目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行实验数据处理分析，实验结果以和n（%）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验和χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠CT感染体征观察

阴道接种CT感染液的小鼠食欲降低，活动减少，外阴出现轻微红肿症状，分泌物增加，且颜色清亮或浑浊，部分小鼠出现毛发脱落现象。未进行阴道接种CT感染液的空白对照组小鼠饮食进水正常，活动正常，外阴颜色正常，无明显分泌物。

2.2 各组小鼠CT感染阳性率变化情况

感染后第4天，空白对照组小鼠CT感染阳性率为0.00%，其他各组小鼠CT感染阳性率均为100.00%，说明整个实验过程无污染，CT感染小鼠模型造模成功。感染后第4天、7天、14天、21天、28天，感染组小鼠CT感染阳性率均显著高于空白对照组（P＜0.05）；感染后第14天，LJⅠ308组和阿奇霉素组小鼠CT感染阳性率显著低于感染组（P＜0.05）；感染后第21天、28天，LJⅠ308联合阿奇霉素组小鼠CT感染阳性率为0.00%，显著低于LJⅠ308组和阿奇霉素组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠CT感染阳性率变化情况Table 1 Changes in CT infection positive rate of mice in each group（n=16） n（%）

2.3 各组小鼠阴道分泌液中CT包涵体数目比较

感染后第4天，各组小鼠阴道分泌液中CT包涵体数目差异均无统计学意义（P＞0.05）；感染后第7天、14天、21天、28天，LJⅠ308组和阿奇霉素组小鼠阴道分泌液中CT包涵体数目显著少于感染组（P＜0.05），LJⅠ308联合阿奇霉素组小鼠阴道分泌液中CT包涵体数目显著少于LJⅠ308组和阿奇霉素组（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠CT包涵体数目比较Figure 1 Comparison of CT inclusion bodies of mice in each group

2.4 各组小鼠生殖道组织病理学改变情况

空白对照组小鼠生殖道组织黏膜上皮细胞形态完整，排列整齐，无炎性细胞浸润现象，固有层间质无水肿；感染后第28天，感染组小鼠生殖道组织黏膜上皮表层细胞排列紊乱，存在明显细胞变性坏死，黏膜上皮弥漫分布大量炎症细胞聚集，固有层间质明显水肿，固有层毛细血管明显扩张。与感染组比较，LJⅠ308组、阿奇霉素组小鼠生殖道组织病理症状相对减轻，可见少量炎症细胞浸润，而LJⅠ308联合阿奇霉素组小鼠生殖道组织病理症状较LJⅠ308组、阿奇霉素组改善更为明显。见图2。

图2 感染后第28天各组小鼠生殖道组织病理图（HE染色）Figure 2 Histopathology of reproductive tract of mice in each group on the 28th day after infection（HEstaining）

2.5 RSK信号通路抑制剂LJⅠ308作用后小鼠生殖道组织中RSK信号通路相关蛋白表达情况

与空白对照组比较，感染组小鼠生殖道组织中p‑RSK/RSK比值显著升高（P＜0.05）；与感染组比较，LJⅠ308组、阿奇霉素组小鼠生殖道组织中p‑RSK/RSK比值显著降低（P＜0.05），且LJⅠ308联合阿奇霉素组小鼠生殖道组织中p‑RSK/RSK比值显著低于LJⅠ308组和阿奇霉素组（P＜0.05），见图3。

图3 各组小鼠生殖道组织中RSK信号通路相关蛋白表达情况Figure 3 Expression of RSK signal pathway related proteins in reproductive tract of mice in each group

3 讨论

衣原体属于原核细胞型微生物，广泛存在于自然界，其寄生于宿主细胞内形成类似病毒的独特发育周期，可导致人类与动物的多种疾病。CT是对人有致病作用的衣原体之一，不仅可引起沙眼、包涵体结膜炎、婴幼儿肺炎，还可经过性传播途径引起多种泌尿生殖道感染疾病[10]。目前，CT感染主要以大环内酯类抗生素治疗为主，大环内酯类抗生素能与细菌核蛋白体的50 S亚基结合，抑制转肽作用和信息核糖核酸的转移，阻碍细菌的蛋白质合成，从而起到抑菌作用。但由于大环内酯类抗生素胃肠道反应严重，所需治疗时间长，导致很多患者不能坚持治疗，使得CT感染无法完全治愈，甚至出现多次重复感染的现象[11‑12]。因此，探索新的药物或新的方法治疗CT感染是当前临床亟待解决的重要问题之一。

RSK是MAPK/ERK信号通路下游的重要信号转导分子，活化后的RSK可转位至细胞核中调节细胞核内的靶分子，进而参与细胞周期调控、调节细胞增殖和凋亡等过程[13‑15]。Davies等[16]研究发现RSK抑制剂LJⅠ308能够通过消除癌症干细胞克服化疗耐药性，提高癌症患者的生存期，LJⅠ308有望成为靶向治疗癌症的有效药物。本研究探索RSK抑制剂LJⅠ308在CT感染中的体内作用，以CT生殖道感染小鼠模型为研究对象，结果发现LJⅠ308作用于CT生殖道感染小鼠，能够显著降低小鼠生殖道CT感染阳性率，减少小鼠生殖道内的CT包涵体数目，并且LJⅠ308和阿奇霉素联合使用效果优于单用LJⅠ308和阿奇霉素的作用，二者联合具有协同作用。

生殖道衣原体感染可诱导机体促炎症细胞因子产生和释放，过度的炎症反应刺激会引起生殖道组织病理性损伤[17‑18]。本研究在经CT感染后第28天取小鼠生殖道组织进行HE染色观察，结果显示，感染组小鼠生殖道组织黏膜上皮表层细胞存在明显的变性坏死和炎症细胞聚集现象，固有层间质有明显水肿和毛细血管扩张状况。而经过LJⅠ308和阿奇霉素干预的小鼠，生殖道组织病理损伤相对减轻，炎症细胞浸润减少，LJⅠ308和阿奇霉素联合作用的小鼠，生殖道组织症状改善更为明显。该结果进一步说明LJⅠ308对CT感染具有抑制作用，LJⅠ308和阿奇霉素联合起协同效果，能够有效减轻小鼠生殖道组织病理损伤。此外，本研究检测小鼠生殖道组织中RSK信号通路相关蛋白表达情况，发现RSK信号通路抑制剂LJⅠ308显著下调CT感染小鼠生殖道组织中磷酸化RSK蛋白表达，且LJⅠ308与阿奇霉素联合处理对CT感染小鼠生殖道组织中磷酸化RSK蛋白表达的下调作用明显优于单用LJⅠ308和阿奇霉素。表明LJⅠ308通过抑制RSK信号通路活性发挥抗CT感染作用。

综上所述，RSK信号通路抑制剂LJⅠ308对CT感染具有明显的抑制作用，LJⅠ308联合阿奇霉素在抑制CT感染方面起着良好的协同作用，LJⅠ308有望成为阿奇霉素治疗CT感染的有效佐剂，但其具体作用机制还需进一步研究。