HPLC测定如达-6中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量

李焕婷，黄沂霖，杨庆瑞，韩梅，任浩蕊，高博闻*

（包头医学院·内蒙古包头·014040）

如达-6由木香、栀子、石榴皮、闹羊花、荜茇、豆蔻6味药材组成，蒙医常因病情需要，将闹羊花用瞿麦[1-2]。根据这个方剂制成的成药，在市场上销售的有六味木香胶囊和六味木香丸，具有开郁行气，止痛的功效，用于胃痛、腹痛，嗳气呕吐。其中木香具有行气止痛、健脾消食的作用，可用于泄痢后重、不思饮食等症状[3]。木香中的主要有效成分为倍半萜内酯类化合物木香烃内酯和去氢木香内酯，具有抗炎、降血糖、抗肿瘤等作用[4-6]。《中国药典》2020年版规定木香烃内酯和去氢木香内酯为木香质量控制的指标[2]。目前，已有文献报道了对如达-6中胡椒碱、栀子苷的含量测定的方法，但未见有同时测定如达-6中木香烃内酯和去氢木香烃内酯含量的相关报道[7-9]。本实验通过高效液相色谱法测定如达-6中木香烃内酯和去氢木香烃内酯的含量，操作简单、精密度高、稳定性好、重复性好，为如达-6中木香烃内酯和去氢木香内酯质量标准的研究奠定了基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液性色谱仪(日本岛津公司）；AS10200超声波清洗机（北京华瑞博远科技发展有限公司）；XS205DU十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

木香烃内酯对照品（成都埃法生物科技有限公司，批号AF20052305，纯度98%）和去氢木香内酯对照品（成都埃法生物科技有限公司，批号AF21060247，纯度98%）；如达-6（供试品1：六味木香胶囊，江西仁丰药业有限公司，批号210304；供试品2：六味木香丸，包头市蒙中医院制剂室制，批号2006051）。甲醇为色谱醇，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备

取对照品木香烃内酯1.87 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度线，摇匀，即得木香烃内酯对照品溶液（浓度为0.187 mg/ml）；取对照品去氢木香内酯1.57 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度线，摇匀，即得去氢木香内酯对照品溶液(浓度为0.157 mg/ml)。

2.1.2 供试品溶液制备

取本品适量，研碎，取2.00 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理60 min,放冷，再次称定重量，甲醇补足失重，摇匀，离心后经0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Chrom Core 120-C18(4.6×250 mm,5 μm）；流动相：甲醇-水（65∶35）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：20 μL；检测波长：225 nm。

2.3 专属性试验

分别吸取对照品溶液及供试品溶液各20 μL，按“2.2”项下色谱条件进样并分析，根据保留时间和色谱图定性。供试品溶液色谱图中，在对照品溶液色谱图中两个对应的保留时间处有相同的色谱峰，详见图1。

2.4 线性关系考察

精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，加甲醇分别制成浓度为0.998 mg/ml的木香烃内酯对照品溶液和1.317 mg/ml的去氢木香内酯对照品溶液。分别精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯对照品溶液0.2、0.5、1、2、4 ml置10 ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，按“2.2”项下色谱条件进行测定。以浓度（C）为横坐标、峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，计算回归方程和相关系数，详见表1。

表1 木香烃内酯和去氢木香内酯的线性方程和相关系数

2.5 稳定性试验

取同一供试品（批号2006051），按“2.2”项下色谱条件，分别于供试品溶液制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样并记录色谱峰面积。结果显示，木香烃内酯和去氢木香烃内酯的RSD分别为1.02%和1.13%。表明供试品溶液在24h内基本保持稳定。

2.6 精密度试验

取同一供试品溶液(批号2006051)，按“2.2”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果，测得的木香烃内酯和去氢木香烃内酯的RSD分别为0.57%和0.89%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一批供试品（批号2006051）6份，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，进样20 μL并记录峰面积。结果，木香烃内酯和去氢木香内酯的平均含量为7.95 mg/g和9.71 mg/g,RSD分别为1.52%和0.72%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

称取木香烃内酯和去氢木香内酯含量为7.95 mg/g和9.71 mg/g的同一批供试品（批号2006051）9份，各约0.2 g,精密称定后放入具塞锥形瓶中，分成,3组，每组3份。各组分别加入木香烃内酯（浓度为0.798 mg/g）和去氢木香内酯（浓度为0.971 mg/g）的对照品溶液各1、2、3 ml(约相当于供试品含有量的50%、100%、150%）及甲醇20 ml。按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样并记录峰面积，计算回收率。结果见表2、3。

表2 木香烃内酯加样回收率实验结果

表3 去氢木香内酯加样回收率实验结果

2.9 供试品含量测定

取3批供试品，每批平行测定3次，每份约1.00 g，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，采用外标法计算含量，结果见表4、5。

表4 供试品中木香烃内酯含量测定结果

表5 供试品中去氢木香内酯含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

参考《中国药典》2015年版一部“木香”项下含量测定规定，以HPLC测定木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，选用225 nm作为检测波长。

3.2 超声提取时间的选择

为保证被测组分提取完全，在供试品粉碎度、提取溶剂和超声功率一致得情况下，分别考察了超声提取时间为20、30、40 min的木香烃内酯和去氢木香内酯提取效率。结果显示，超声提取20、30、40 min时，供试品中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量基本相同，故选择超声提取时间为30 min,与《中国药典》2015年版一部“木香”项下含量测定的提取时间一致。

3.3 柱温的选择

试验不同柱温25、30、35、40℃对实验结果的影响。结果显示，温度越高，保留时间减短，出峰时间会整体前移，但是木香烃内酯和去氢木香烃内酯的分离度并不会受到影响，故在保护色谱柱的前提下，选择柱温为30℃。

4 结论

本实验通过高效液相色谱法测定如达-6中木香烃内酯和去氢木香烃内酯的含量，操作简单，经方法学验证，精密度高、稳定性好、重复性好，可作为如达-6中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定方法。