复方万年青胶囊联合氟尿嘧啶注射液（5-FU）对胃癌荷瘤小鼠的免疫调节作用及其抗癌机制研究

曲笑锋，石菊，李铁锡，于艳辉，刘松枝，唐晓桐，徐建，鄢必新*

(1.吉林修正药业新药开发有限公司，长春130103；2.吉林天力泰药业有限公司，长白朝鲜族自治县134400)

复方万年青胶囊处方包含虎眼万年青、半枝莲、虎杖、郁金、白花蛇舌草、人参、丹参、黄芪、全蝎、蜈蚣。功能主治为解毒化瘀，扶正固本。用于肺癌、肝癌、胃癌化疗合并用药，且具有减毒增效的作用。本研究基于胃癌荷瘤小鼠模型，通过体外检测免疫调节相关指标及NF-kb p65/p38水平，探究其作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

BALB/c小鼠，雌雄各半，18～22g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号：SCXK（吉）2020-0002。

1.2 药物

复方万年青胶囊：由吉林天力泰药业有限公司提供，批号：20190701；氟尿嘧啶注射液（5-FU）：江苏豪森药业集团有限公司，批号：190604；10×电转液：Solarbio，批号：D1060-500；5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，Solarbio，批号：T1070-500；5×loading buffer：Biosharp，批号：660272；1×PBST缓冲液：Solarbio，批号：T1070-500，P1031-500；高灵敏度ECL化学发光试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20191121；Page Ruler Prest：thermofisher，批号：00318120；βactin：BOSTER，批号：BA2305；P38 MAPK：CST，批号：8690；NF-kb/p65，CST，批号：8242；山羊抗兔二抗：BOSTER，批号：BA1054；山羊抗鼠二抗：BOSTER，批号：BA1050；PBS：HyClone，批号：AE29449011；RPMI1640培养基：HyClone，批号：AE29163435；Gey′s红细胞裂解液：源叶生物，批号：L14M11G113128；LDH试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20201228；IgG试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20201228；IgM试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20201228；TNF-α试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20201229。

1.3 仪器

SMP500-18272-LSIO酶标仪；JA1103N型电子天平；HHS水浴锅；低温高速离心机；Trans-blot SD cell半干转膜仪；Gel imaging system；MCO-18AIC二氧化碳培养箱。

2 方法

2.1 分组

BALB/c小鼠84只，随机分为7组，每组12只，雌雄各半，分别为空白对照组、模型对照组、5-FU对照组、复方万年青胶囊1倍临床剂量对照组、复方万年青胶囊3倍临床剂量对照组、复方万年青胶囊1倍临床剂量+5-FU联合组（0.5g·kg-1+70mg·kg-1）、复方万年青胶囊3倍临床剂量+5-FU联合组（1.5g·kg-1+70mg·kg-1），连续给药14d。

2.2 制备胃癌细胞悬液

小鼠腹腔接种胃癌瘤液后，待腹部出现明显的腹水处死，仰卧固定，消毒皮肤，用眼科剪小心剥离表皮，露出外膜，抽取腹腔肿瘤积液，以0.9%氯化钠注射液稀释，调整细胞浓度至2.0×106个/mL，放在冰浴中备用。

2.3 接种小鼠胃癌实体瘤模型的建立

除空白组以外，于无菌条件下抽取接种于小鼠7d的生长良好的腹水，按6×106mL，每只0.2mL接种于小鼠腹腔内进行建模[1-5]。24h后，空白组、模型组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液10mL·kg-1，每天1次，5-FU对照组1次/14d，复方万年青胶囊联合5-FU低剂量组、复方万年青胶囊联合5-FU高剂量组，腹腔注射5-FU，同时分别灌胃给药，每天1次。以上各组连续给药14d。

2.4 Western Blot样品制备[6-7]

取荷瘤胃癌小鼠瘤体组织约50mg，加入800μL细胞裂解液，利用组织研磨器充分研磨组织，放入4℃垂直旋转1h，12000rpm，离心20min，取上清，测量蛋白含量，-80℃保存待用。根据蛋白浓度，取50μg蛋白，与5×蛋白上样缓冲液混匀，在98℃加热器上加热5min，瞬离10s。10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白，80V，20min，待样品进入分离胶后，调整100～120V，80min。取出凝胶转膜，20V，50min。转膜后用含有5%脱脂奶粉的PBST封闭至少1h后，弃掉封闭液，孵育一抗（3% BSA的PBST按1∶1000比例稀释），4℃，过夜。回收一抗，PBST洗三次，10min/次。孵育二抗（5%脱脂奶粉按1∶1000稀释）室温，摇床，孵育45min。弃二抗，PBST洗三次，10min/次。将显色液A和B按照1∶1的比例混匀，均匀滴加于膜上，化学发光仪检测NF-kb p65、p38蛋白的表达情况。

2.5 对荷瘤小鼠血清酶学指标的影响[8]

采集小鼠外周血，放置于-80℃保存，用于随后的检测。通过酶联免疫试剂盒检测免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、肿瘤坏死因子α（TNF-α），相关操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.6 对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响[9-11]

2.6.1 脾细胞悬液的制备

小鼠脱颈椎处死，剪开肌层无菌取脾，置于预冷PBS的培养皿中，剥离剩余脂肪和胰腺。剪碎脾脏通过70μm细胞过滤器以收集单细胞悬浮液。将细胞悬浮液1500转，5min离心后用Gey′s溶液裂解红细胞，静止3min后再次离心。反复裂解离心直至无红色沉淀，用PBS重悬即收获脾细胞悬液。

2.6.2 NK细胞活性测定

对K562细胞以及脾细胞进行活细胞计数。将100μL K562细胞作为靶细胞（2.5×106个/mL）加入到96孔培养板的每个孔中。将100μL脾淋巴细胞用作效应细胞（1×107个/mL）添加至每个测试孔。同时设最大释放孔及空白对照孔。即：

测 试 孔：K562 100μL+脾细胞100μL

空白对照孔：K562 100μL+RPMI1640 100μL

最大释放孔：K562 100μL+LDH释放剂（稀释后）100μL

细胞于37℃、5%CO2条件下培养4h后使用LDH测定试剂盒测量LDH水平。基于公式计算NK细胞的细胞毒率：

ODtest表示试验孔的吸光度，ODmin表示空白对照孔的吸光度，ODmax表示最大释放孔的吸光度。

2.7 统计分析

实验数据统计采用SPSS 19.0软件，结果用均值±标准差表示，P<0.05具有统计学差异；Western Blot法检测蛋白表达情况后，利用Image J、Graphpad Prism软件分析蛋白表达量。

3 实验结果

3.1 对免疫调节作用的影响

3.1.1 对荷瘤小鼠血清酶学指标的影响

结果表明，与空白对照组比较，模型对照组荷瘤小鼠血清中IgM、IgG、TNF-α活性有不同程度升高（P<0.05，P<0.001）；与模型对照组比较，复方万年青胶囊3倍临床剂量+5-FU联合组荷瘤小鼠血清中IgM、IgG、TNF-α活性不同程度降低（P<0.05，P<0.001），复方万年青胶囊1倍临床剂量+5-FU联合组荷瘤小鼠血清中IgM、IgG明显降低（P<0.01）；与5-FU对照组比较，复方万年青胶囊3倍临床剂量+5-FU联合组荷瘤小鼠血清中IgG活性明显降低（P<0.01），复方万年青胶囊1倍临床剂量+5-FU联合组荷瘤小鼠血清中IgG活性极明显降低（P<0.001），详见表1。

3.1.2 对荷瘤小鼠NK细胞杀伤率的影响

各实验组小鼠NK细胞杀伤率分别为81.5%、41.1%、159.6%、96.2%、86.3%、120.6%和194.2%，详见表2。

3.2 对NF-kb p65/p38水平的影响

结果表明，与模型对照组比较，5-FU对照组与复方万年青胶囊1倍、3倍临床剂量+5-FU联合组均能够下调NF-kb p65/p38水平；复方万年青胶囊1倍、3倍临床剂量组可使NF-kb p65/p38水平升高，详见图1。

4 讨论

胃癌是全球十大恶性肿瘤之一，其发病隐匿，进展迅速，多数患者确诊时已为进展期，临床研究显示，在接受手术的患者中，有50%左右患者在1年内复发，2年内复发转移则占70%率以上[12]。大量基础研究表明，肿瘤周围免疫抑制的炎症微环境是肿瘤形成的重要因素，可推动胃癌的恶性进程和治疗失败。而中医药在调节机体免疫方面有传统优势，多项研究已证实，中药有减轻肿瘤微环境的免疫抑制状态、治疗肿瘤的作用[13]。复方万年青胶囊以清热解毒药虎眼万年青、半枝莲、虎杖、白花蛇舌草为君，以补气升阳药人参、丹参、黄芪为臣，以郁金、全蝎、蜈蚣为佐使进行配伍，具有解毒镇痛、散结消肿的功效，清热解毒的同时，补气升阳、活血止痛，调节机体免疫功能。

NK细胞可以通过自然杀伤和介导抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）直接杀伤靶细胞[14]，它不依赖抗体和补体而直接实现免疫功能，NK细胞的活性更是衡量机体免疫的重要指标。本研究采用BALB/c小鼠的腋下移植瘤模型，研究复方万年青胶囊的免疫调节作用[15,16]，实验结果表明，复方万年青胶囊联合氟尿嘧啶注射液能明显增加小鼠NK细胞杀伤率，且复方万年青胶囊与氟尿嘧啶注射液联合组荷瘤小鼠血清中IgG、IgM含量明显降低并趋于正常水平，同时炎性因子TNF-α活性明显降低，提示复方万年青胶囊对氟尿嘧啶注射液的癌症治疗具有增效作用，具有明显的免疫调节功能。

肿瘤细胞在细胞生理学方面有6个标志性改变：生长自给自足、逃避凋亡、对生长抑制信号的不敏感、无限增殖性、血管生成、组织侵袭性和转移性[17,18]。很多介导这些效应的基因转录受NF-kb调控；MAPK通路是近年来发现的与肿瘤细胞凋亡有关的信号转导通路，包括JNK、ERK、p38等关键调控因子。其中，p38受细胞因子、药物、辐射等刺激而产生相应作用，参与肿瘤细胞的发生和进展。有研究显示p38表达异常与肿瘤患者生存期显著相关，活化的p38可以抑制Bcl-2活化和诱导Bax转位，并通过诱导线粒体凋亡途径促进肿瘤细胞凋亡[19-22]。本研究结果显示，复方万年青胶囊单独给药NF-kb p65/p38水平升高，联合用药后可有效降低NF-kb p65/p38 MAPK比值，而p38活性的增强可抑制Bcl-2活化，达到促进细胞凋亡发生的目的。综上所述，复方万年青胶囊联合5-FU可能通过降低NF-kb p65/p38水平，抑制Bcl-2活化，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡的发生。