补肾宁心颗粒多种活性成分同时测定

李旭辰,高颖,柳成林,韩文静,于秀华*,黄晓巍*

（1.长春中医药大学药学院，长春130117；2.中国人民解放军联勤保障部队第964医院南湖院区，长春130021）

补肾宁心颗粒是我院经验方，由丹参、当归、赤芍、益母草、牛膝、苍术、茯苓、续断、熟地黄、柏子仁、香附、石菖蒲、泽兰、焦山楂14味中药材组成的复方制剂，具有补肾活血，祛瘀通络功效。可以降低中枢神经中的NE、DA的含量，使中枢神经由兴奋转向抑制[1]。达到了使心血管系统受其影响的可能性降低的作用，因此推测该药可以抑制中枢神经产生兴奋，并且可以有效控制或抑制NE和DA的合成和释放。该颗粒中赤芍的主要成分为芍药苷、苍术主要成分苍术素、丹参主要成分丹酚酸B等，能够作为本品的有效指标成分。经研究芍药苷抗抑郁、调节免疫、保肝、抗炎镇痛、抗肿瘤、保护神经、抗糖尿病并发症等药理作用的研究较为深入[2]。苍术素抗炎作用主要表现为抑制炎性细胞因子，促进胃排空作用主要表现为激活GHSR，抗肿瘤作用则表现为抑制癌细胞增值[3]。丹酚酸B具有治疗效果对于心肌梗死、动脉粥样硬化及心肌缺血等心血管疾病[4]。笔者主要对补肾宁心颗粒进行了定量研究，采用对指标性成分苍术素、芍药苷和丹酚酸B运用高效液相色谱(HPLC)法进行测量分析来测其含量，达到质量控制的目的，同时对该药的安全性提供保障，为临床的质量控制和使用提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

TP-300超声波清洗器（天鹏电子新技术（北京）有限公司）；BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津，SPD检测器）；纯水（长春中医药大学附属医院实验中心）；AMW220D型电子分析天平（日本岛津）；XS-225A电子天平（OHAHS公司）；所用试剂均为分析纯。

1.2 试药

补肾宁心颗粒（批号：20190301，来源：长春中医药大学附属医院制剂中心）；对照品：苍术素（111924-201605）、丹酚酸B对照品（120976-200503）芍药苷（110736-201741）均购于中国药品生物检定所。

2 方法与结果

2.1 对照品混合溶液的制备

首先，分别称取芍药苷10.0mg、苍术素6mg和丹酚酸B 17mg三种对照品小心转移分别各自放入25ml、100ml、100ml的棕色容量瓶之中，然后在其中用移液枪少量多次加入有机溶剂甲醇定容，制成了每5ml含芍药苷、苍术素和丹酚酸B分别为2.0mg、0.3mg 0.85mg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取本品(补肾宁心颗粒)，研成极细的粉末，使用分析天平称量研磨好的5g该粉末，后将其加到锥形瓶中，再加入用移液管称量的25ml的甲醇溶剂，后再次称量并记录此时锥形瓶和溶液的总质量，超声处理30min后，再进行称定重量，滴加甲醇，使此时质量与先前质量记录一致，然后进行摇匀，滤过，取续滤液。

2.3 色谱条件

为了达到、提高各成分之间的分离度、缩短分析时间、改善各成分峰的峰形的目的，选择流动相0.2%H3PO4溶液（A）-乙睛（B），使用梯度洗脱的洗脱方式，即为：0-30min，22% B，78% A；30-65 min，65% B，35% A；65-70 min，22% B，78% A，流速为1.0ml/min，检测波长为286nm、230nm、340nm，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂Apollo-C18色谱柱（250mm×4.6 mm）。

2.4 专属性考察

分别精密吸取“2.1”项下制成含有芍药苷、苍术素和丹酚酸B三种对照品的溶液，分别取适当的量制成，注入色谱仪当中，对其进行进样检测。同时进样分析“2.2”项下的供试品溶液。结果显示如图1-6，说明阴性对其并没有出现干扰，证明了此方法可行。

由上图可知，各指标性的峰分离度良好，并未出现峰拖尾、分叉等不良峰型。且样品的出峰时间与对照品的出峰时间能够对应上，能够很好的符合规定。

2.5 线性关系考察

取“2.1”项下的混合对照品溶液依次为4.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0μl，使其稀释成不同的浓度，进样分析，采用“2.3”项下的方法测定，以峰面积积分值（Y）-对照品进样量（X），采用线性回归分析的方法，结果见表1。

表1 线性关系考察表

2.6 精密度检验

精密度检验即为不同仪器、不同时间、不同人员分别按上述的色谱条件进行测定，取“2.1”项下的混合对照品溶液10 μl，进样检测。结果芍药苷、苍术素和丹酚酸B的峰面积的RSD值0.07%、0.36%、0.25%。数据核算无误，得到结果精密度良好。

2.7 稳定性试验

使用上述建立的色谱条件进行测定，稳定性试验目的在于对供试品的稳定性进行合理评价，在一定时间内，于0、2、4、8、12、24h进样10 μl。精密吸取“2.2”下供试品溶液，依法测定，芍药苷、丹酚酸B、苍术素峰面积的RSD值分别为0.39% 0.63%、1.07%。得到结果稳定性良好。

2.8 回收率试验

取样品，精密量取本品2.5g（芍药苷含量为1.8603mg/g，丹酚酸B含量为0.72 mg/g，苍术素含量为0.26 mg/g），加入甲醇和对照品适量，置25ml量瓶中。按上述所建立的液相色谱条件，计算回收率，进样分析。为保证数值稳定可靠，计算出了丹酚酸B RSD值1.50%、芍药苷的RSD值为1.74%、苍术素RSD值1.07%，均符合要求。平均加样回收率结果分别为丹酚酸B 97.68%、芍药苷97.45%、苍术素96.88%。本实验的结果证明了该高效液相测量方法的准确性较好。

2.9 重现性试验

首先，取相同批次的颗粒，将其配制为“2.1”项下的供试品溶液，然后对其各自分离的测定。重现性实验的目的提高测量数据的准确性，适量进样，测量6次。丹酚酸B、芍药苷、苍术素RSD值为2.46%、1.85%、2.80%，符合规定要求，实验成果证明该液相色谱的方法具备着优良重复性。

2.10 耐用性考察

2.10.1 不同色谱柱

选用WondaSil NH18柱（4.6×250mm，5μm）和GRACE NH18柱（4.6×250mm，5μm），选取作为同一供试品溶液，以0.2%H3PO4溶液为流动相A，以为乙腈流动相B，选用不同厂家C18色谱柱，在“2.2”下的色谱条件下，检测波长为230nm、286nm、340nm，柱温30℃，选用梯度洗脱的洗脱方式，进行测定。

2.10.2 检测波长

取同一供试品溶液，0.2% H3PO4溶液为流动相A，乙腈为流动相B。为了检验波长，其余均选用与前文一致的方法，按规定进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30℃，YWG-C18柱（4.6×250 mm，5μm）为达到实验效果，选用与前文完全不同的波长进行测定，分别于228nm、288nm、338nm测定。

2.10.3 柱温的影响

选用与前文相同的上述色谱柱，即C18色谱柱,选择了不同的温度作为不同柱温。选用了柱温分别为30℃和40℃，取同一供试品溶液，其余均与前文保持一致。在340 nm、286 nm、230 nm下进行检测。

2.10.4 不同流速的影响

取同一供试品溶液，以0.2% H3PO4溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，为探究流速对试验结果的影响，分别以流速0.8、1.0、1.2 ml/min的不同流速进行测定。用C18为填充剂，选用了YWG-C18柱（4.6×250mm，5μm），进行梯度洗脱，柱温维持30℃；吸收波长为230nm、286nm、340nm。

得出以上的操作均不会影响含量测定的结果，当测试的条件发生了适度的变化时。

2.11 测定含量

精密吸取10μl对照品混合溶液、供试品溶液进样检测，得到的实验结果即为，补肾宁心颗粒中每袋颗粒中，补肾宁心颗粒中以芍药苷(C23H28O11)、丹酚酸B(C36H30O16)和苍术素(C13H10O)含有的赤芍、丹参和苍术的生药量，分别不得少于15.0mg、5.0 mg和1.8 mg。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

主要参考了中国药典一部对于各药材进行含量测定项下的制备方法的部分，以及查阅了有关文献，研究芍药苷、苍术素、丹酚酸B在不同制备方法下所得的含量。考虑到由于该药品的有效成分具有极性，且更成分之间极性也各不相同，所以分别加入甲醇、75%甲醇、乙醇等不同的有机溶剂来对其进行溶解，能够达到其分离溶解的目的，并以超声、加热回流等提取的手段，从而得出的实验结论：一是关于提取方法对含量的影响，没有显著性差异的两种提取方法，即回流提取方法和超声提取方法，这两种均为中药提取方法中较为常见的两种提取方法，由这两种方法所得到的含量十分接近，并不存在显著差异，然而为了减少实验成本和花费的时间，超声提取的操作容易方便，更加大大的减少了提取的时间，并且实验成本相对较低，因此为本次实验选择的样品提取方法为超声提取30min；二是不同有机溶剂所产生的提取效果对各含量的影响，使用甲醇做为溶剂，测得的有效成分含量较高，对含量的影响较大，因此采用甲醇作为溶剂。综上所述，选择了操作更为简单方便的超声提取30min的方法，并选择了甲醇作为有机溶剂，使得到的指标性成分含量跟高的方法。确定采用“2.1”“2.2”项下的方法作为制剂中含量提取的方法。即为上文中选择的方法。

3.2 检测波长的确定

根据对照品芍药苷、丹酚酸B、苍术素的紫外吸收图，最大吸收峰为232nm、287 nm、336 nm，结合药典确定最大吸收为230 nm、286 nm、340 nm。

3.3 选择芍药苷、丹酚酸B、苍术素作为指标性成分的依据

芍药苷作为赤芍的主要有效成分，它与赤芍的多种药用治疗作用皆有关联[5]。研究表明，具有抗血栓、淤血，同时还拥有清热、抗炎，以及抗毒素的作用[6-8]，符合赤芍的中药主治，同时也是中药赤芍发挥作用的主要所在。选用芍药苷作为对颗粒质量的控制，研发、合理利用。丹酚酸B为水溶性活性成分，是丹参中的指标性成分。其能够良好的溶于制剂当中，具有防止心血管疾病的重要作用，近年来研究发现[9-11]，此成分对于治疗缺血性心脏病具有良好的理论根据，并发现了它的作用机制。丹酚酸B可以作为项指标性成分衡量此颗粒标准，综合上述。苍术具有止痛燥湿的功效[12,13]，对于消化系统具有良好的治疗作用，对于修复胃黏膜，治疗胃溃疡具有极好的功效，苍术素作为苍术的特征性成分，能够很好的反应出本颗粒中苍术所发挥的药用价值。