LncRNA PTPRG⁃AS1通过靶向miR⁃5590⁃3p调控乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

高媛媛 胡萍 赵艳姣 黄英★

乳腺癌是发生于女性的常见肿瘤，且其发病呈年轻化趋势［1］。近年来，乳腺癌的诊断和治疗有了极大提高，但仍有部分患者易复发和转移［2］。因此，进一步探究乳腺癌发生发展的分子机制，探索乳腺癌的治疗靶标具有十分重要的意义。蛋白酪氨酸磷酸酶受体G 的反义RNA1（protein tyrosine phosphatase receptor type G antisense RNA 1，PT⁃PRG⁃AS1）是一种长链非编码RNA（long non⁃cod⁃ing RNA，lncRNA），其在上皮性卵巢癌［3］、胃癌［4］和鼻咽癌［5］等多种肿瘤中表达上调，促进这些肿瘤的发展进程。然而，lncRNA PTPRG⁃AS1 对乳腺癌发生发展的影响还未知。Starbase 靶基因在线软件预测显示，PTPRG⁃AS1 可能与微小RNA（mi⁃croRNA，miR）⁃5590⁃3p 存在靶向调控关系。miR⁃5590⁃3p 在三阴性乳腺癌组织及细胞中表达下调，过表达miR⁃5590⁃3p 阻碍了三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移，miR⁃5590⁃3p 可作为该肿瘤治疗的分子靶点［6］。本研究主要观察了PTPRG⁃AS1 对乳腺癌细胞恶性行为（增殖、迁移和侵袭）及其能否靶向miR⁃5590⁃3p 发挥作用，以期了解其对乳腺癌发生发展的影响，为乳腺癌的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

正常乳腺上皮细胞MCF⁃10A 及乳腺癌细胞系（MCF⁃7、T47D 和BT549），中国科学院上海细胞库；细胞计数试剂盒⁃8（cell counting kit⁃8，CCK⁃8）试剂盒（规格500 T，20210117）、RPMI 1640 培养液（规格500 mL，20210315）、二喹啉甲酸（bicincho⁃ninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒（规格50 T，20201218）和双荧光素酶活性检测试剂盒（规格100 T，20200312），北京索莱宝；胎牛血清（规格100 mL，20210116），浙江天杭生物科技股份有限公司；RNA 抽提试剂盒（规格100 mL，20201213）、逆转录试剂盒（规格20 μL 反 应×100 次，20201109）和聚合酶链式反应（polymerase chain re⁃action，PCR）试剂盒（规格200 Rxns，20210123），大连宝生物；LipofectamineTM2000 试剂盒（规格0.75 mL，20210425），美国Invitrogen 公司；引物序列、LncRNA PTPRG⁃AS1 小干扰RNA（si⁃LncRNA PT⁃PRG⁃AS1）、小干扰RNA 阴性对照序列（si⁃NC）、miR⁃5590⁃3p 模拟物（mimcs）和抑制剂（anti⁃miR⁃5590⁃3p）、模拟对照序列（miR⁃NC）和抑制剂阴性序列（anti⁃miR⁃NC）、LncRNA PTPRG⁃AS1 野生型（WT）和突变型（MUT）荧光素酶报告基因载体，上海生工；β⁃肌动蛋白（β⁃actin，规格100 μL，ab156302）、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein⁃ase，MMP）2（规格100 μL，ab92536）和MMP9（规格100 μL，ab283575）抗体，中国Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

复苏正常乳腺上皮细胞MCF⁃10A 及乳腺癌细胞系（MCF⁃7、T47D 和BT549），均用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液（完全培养液）置于CO2培养箱中培养。

1.2.2 实时定量PCR（real⁃time quantitative PCR，qRT⁃PCR）法检测LncRNA PTPRG⁃AS1 和miR⁃5590⁃3p 表达

将2.5 mL MCF⁃10A、MCF⁃7、T47D 和BT549细胞（5.0×104个/mL）均接种至6 孔板，培养24 h后，弃培养液，用RNA 抽提试剂盒提取细胞中总RNA。逆转录后，行PCR 反应。2⁃ΔΔCt法计算Ln⁃cRNA PTPRG⁃AS1 相对甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyc⁃eraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase，GADPH）、miR⁃5590⁃3p 相对U6 的表达量。见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 MCF⁃7 细胞转染

将MCF⁃7 细胞接种至6 孔板（5.0×104个/mL），培养24 h 后，用LipofectamineTM2000 脂质体法，分别转染si⁃NC（1 组）、si⁃LncRNA PTPRG⁃AS1（2 组）、miR⁃NC（3 组）、miR⁃5590⁃3p mimics（4组）、共转染si⁃LncRNA PTPRG⁃AS1 与anti⁃miR⁃NC（5 组）、si⁃LncRNA PTPRG⁃AS1 与anti⁃miR⁃5590⁃3p（6 组）。转染12 h 后，换为完全培养液。培养24 h 后，qRT⁃PCR 法检测细胞中LncRNA PT⁃PRG⁃AS1 或miR⁃5590⁃3p 表达验证转染效果。同时设置正常对照（normal control，NC）组，不进行任何转染操作，常规培养。

1.2.4 CCK⁃8 检测细胞增殖活性

将200 μL 各组MCF⁃7 细胞（5.0×104个/mL）接种至96 孔板，培养24 h。加10 μL CCK⁃8，孵育2 h，用酶标仪（450 nm）测吸光度（A）值。

1.2.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭

侵袭：将4℃冰箱中融化的Matrigel 基质胶铺于Transwell 小室上室，自然晾干。然后接种100 μL 各组MCF⁃7 细胞（5.0×104个/mL）加至上室。另取500 μL 完全培养液加至下室。培养24 h 后，弃培养液，将细胞用多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜观察，计数。迁移实验除不铺Matrigel基质胶外，步骤同侵袭实验。

1.2.6 蛋白质印迹法测CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达

将2.5 mL 各组MCF⁃7 细胞（5.0×104个/mL）接种至6 孔板，培养24 h，弃培养液。用RIPA 试剂提取细胞中总蛋白，BCA 法测蛋白浓度后，电泳实验将蛋白分离，并转至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h。然后分别用稀释的CyclinD1（1∶500）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶1000）、β⁃actin（1∶1 000）一抗于4℃冰箱中孵育过夜，洗膜后，再用山羊抗兔二抗（1∶2 000）37℃孵育1 h。加显影液，避光显影，曝光拍照。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验

将2.5 mL MCF⁃7 细胞（5.0×104个/mL）接种至6 孔板，培养24 h，用LipofectamineTM2000 脂质体法，分别共转染LncRNA PTPRG⁃AS1⁃WT 与miR⁃5590⁃3p mimics（或miR⁃NC）、LncRNA PTPRG⁃AS1⁃MUT 与miR⁃5590⁃3p mimics（或miR⁃NC）。转染12 h 后，换为完全培养液。培养24 h 后，裂解细胞。用离心半径10 cm 的离心机离心（3 500 r/min、10 min），收集上清液，检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示。两组间比较用独立样本t检验；多组间比较用单因素方差分析。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞中LncRNA PTPRG⁃AS1 和miR⁃5590⁃3p 表达的比较

与正常乳腺上皮细胞MCF⁃10A 比较，乳腺癌细胞系（MCF⁃7、T47D 和BT549）中LncRNA PTPRG⁃AS1 表达升高，miR⁃5590⁃3p 表达降低，差异均有统计学意义（均P<0.05），且乳腺癌MCF⁃7细胞中LncRNA PTPRG⁃AS1 和miR⁃5590⁃3p 表达较MCF⁃10A 细胞差异尤甚。见表2。

表2 乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞中LncRNA PTPRG⁃AS1 和miR⁃5590⁃3p 表达的比较（±s，n=9）Table 2 Comparison of the expression of LncRNA PTPRG⁃AS1 and miR⁃5590⁃3p in breast cancer cells and normal breast epithelial cells（±s，n=9）

表2 乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞中LncRNA PTPRG⁃AS1 和miR⁃5590⁃3p 表达的比较（±s，n=9）Table 2 Comparison of the expression of LncRNA PTPRG⁃AS1 and miR⁃5590⁃3p in breast cancer cells and normal breast epithelial cells（±s，n=9）

注：与MCF⁃10A 比较，aP<0.05。

组别MCF⁃10A MCF⁃7 T47D BT549 F 值P 值LncRNA PTPRG⁃AS1 1.00±0.11 3.42±0.27a 2.63±0.21a 2.18±0.17a 232.973 0.000 miR⁃5590⁃3p 1.00±0.10 0.41±0.03a 0.51±0.05a 0.58±0.05a 152.528 0.000

2.2 敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 抑制乳腺癌细胞MCF⁃7 增殖、迁移和侵袭

与NC 组或1 组比较，2 组MCF⁃7 细胞中LncRNA PTPRG⁃AS1 表达降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）。2 组MCF⁃7 细胞增殖活性、迁移数、侵袭数及细胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9蛋白表达均低于NC 组或1 组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图1、表3。

表3 敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 抑制乳腺癌细胞MCF⁃7 增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Table 3 Knockdown of LncRNA PTPRG⁃AS1 inhibits the proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF⁃7（±s，n=9）

表3 敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 抑制乳腺癌细胞MCF⁃7 增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Table 3 Knockdown of LncRNA PTPRG⁃AS1 inhibits the proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF⁃7（±s，n=9）

注：与NC 组比较，aP<0.05。

组别NC 组1 组2 组F 值P 值LncRNA PTPRG⁃AS1 1.00±0.10 1.02±0.11 0.45±0.04a 119.203 0.000 CyclinD1 0.91±0.08 0.92±0.09 0.45±0.04a 120.913 0.000 MMP2 0.81±0.06 0.83±0.07 0.41±0.03a 161.234 0.000 MMP9 0.75±0.08 0.73±0.07 0.35±0.03a 112.426 0.000 A 值1.086±0.08 1.081±0.09 0.534±0.05a 159.866 0.000细胞迁移数量（个）231±19.68 227±18.64 116±8.97a 141.103 0.000细胞侵袭数量（个）163±14.03 159±11.95 71±6.51a 191.109 0.000

图1 CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达Figure 1 The protein expression of CyclinD1，MMP2 and MMP9

2.3 过表达miR⁃5590⁃3p 抑制MCF⁃7 乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

与3 组比较，4 组MCF⁃7 细胞中miR⁃5590⁃3p表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）。4 组MCF⁃7 细胞增殖活性、迁移数、侵袭数及细胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达均低于3 组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图2、表4。

表4 过表达miR⁃5590⁃3p 抑制乳腺癌细胞MCF⁃7 增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Table 4 Overexpression of miR⁃5590⁃3p inhibits the proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF⁃7（±s，n=9）

表4 过表达miR⁃5590⁃3p 抑制乳腺癌细胞MCF⁃7 增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Table 4 Overexpression of miR⁃5590⁃3p inhibits the proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF⁃7（±s，n=9）

注：与3 组比较，aP<0.05。

组别3 组4 组t 值P 值miR⁃5590⁃3p 1.00±0.11 2.84±0.23a 21.651 0.000 CyclinD1 0.90±0.07 0.48±0.04a 15.628 0.000 MMP2 0.82±0.07 0.43±0.04a 14.512 0.000 MMP9 0.76±0.07 0.38±0.03a 14.969 0.000 A 值1.083±0.09 0.581±0.05a 14.628 0.000细胞迁移数量（个）229±17.56 102±9.73a 18.978 0.000细胞侵袭数量（个）167±13.54 68±6.39a 19.837 0.000

图2 CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达Figure 2 The protein expression of CyclinD1，MMP2 and MMP9

2.4 LncRNA PTPRG⁃AS1 靶向调控miR⁃5590⁃3p

Starbase 靶基因在线软件预测显示的LncRNA PTPRG⁃AS1 与miR⁃5590⁃3p 的结合位点见图3。共转染LncRNA PTPRG⁃AS1⁃WT 与miR⁃5590⁃3p的MCF⁃7 细胞荧光素酶活性低于共转染LncRNA PTPRG⁃AS1⁃WT 与miR⁃NC 的MCF⁃7 细胞，差异有统计学意义（P<0.05）；共转染LncRNA PTPRG⁃AS1⁃MUT 与miR⁃5590⁃3p 的MCF⁃7 细胞荧光素酶活性与共转染LncRNA PTPRG⁃AS1⁃MUT 与miR⁃NC 的MCF⁃7 细胞比较差异无统计学意义（P=0.630），见表5。同时，si⁃LncRNA PTPRG⁃AS1 组MCF⁃7 细胞中miR⁃5590⁃3p 表达为2.46±0.22，高于si⁃NC 组miR⁃5590⁃3p 的表达量（1.00±0.09），差异有统计学意义（t=18.427，P<0.05）。

图3 LncRNA PTPRG⁃AS1 与miR⁃5590⁃3p 核苷酸序列的结合位点Figure 3 The binding sites of nucleotide sequence between LncRNA PTPRG⁃AS1 and miR⁃5590⁃3p

表5 荧光素酶活性检测结果（±s，n=9）Table 5 Test results of luciferase activity（±s，n=9）

表5 荧光素酶活性检测结果（±s，n=9）Table 5 Test results of luciferase activity（±s，n=9）

注：与miR⁃NC 比较，aP<0.05。

组别miR⁃NC 组miR⁃5590⁃3p 组t 值P 值荧光素酶活性WT 1.00±0.08 0.41±0.03a 20.716 0.000 MUT 1.00±0.10 0.98±0.07 0.492 0.630

2.5 敲减miR⁃5590⁃3p 逆转敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 对MCF⁃7 细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与5 组比较，6 组MCF⁃7 细胞中miR⁃5590⁃3p表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。6 组MCF⁃7 细胞增殖活性、迁移数、侵袭数及细胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达均高于5 组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图4、表6。

表6 敲减miR⁃5590⁃3p 逆转敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 对MCF⁃7 增殖，迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 6 Knocking down miR⁃5590⁃3p reverses the effect of knocking down LncRNA PTPRG⁃AS1 on the proliferation，migration and invasion of MCF⁃7（±s，n=9）

表6 敲减miR⁃5590⁃3p 逆转敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 对MCF⁃7 增殖，迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Table 6 Knocking down miR⁃5590⁃3p reverses the effect of knocking down LncRNA PTPRG⁃AS1 on the proliferation，migration and invasion of MCF⁃7（±s，n=9）

注：与5 组比较，aP<0.05。

组别5 组6 组t 值P 值miR⁃5590⁃3p 1.00±0.11 0.43±0.04a 14.610 0.000 CyclinD1 0.47±0.04 0.92±0.09a 13.707 0.000 MMP2 0.40±0.03 0.85±0.08a 15.801 0.000 MMP9 0.34±0.03 0.73±0.07a 15.363 0.000 A 值0.538±0.05 1.023±0.09a 14.132 0.000细胞迁移数量119±10.61 203±17.94a 12.091 0.000细胞侵袭数量73±6.92 168±15.82a 16.505 0.000

图4 Western Blot 检测CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白的表达Figure 4 Western Blot detects the protein expression of CyclinD1，MMP2 and MMP9

3 讨论

乳腺癌发病隐匿，部分患者在确诊时常伴随局部或远处转移，严重威胁女性生命健康和安全。探究乳腺癌发生发展的分子机制可为其治疗提供新靶点。lncRNA 是一类长链非编码RNA，其在真核生物中广泛存在。随着对lncRNA 研究的深入，发现lncRNA 可发挥miRNA 海绵作用调控miRNA 靶基因的表达，进而参与调控肿瘤细胞的恶性行为，可作为肿瘤治疗的分子靶点［7］。

作为一种lncRNA，PTPRG⁃AS1 也参与肿瘤的发展进程。研究显示，上皮性卵巢癌组织中PTPRG⁃AS1 的表达明显高于癌旁组织，其表达与患者远处转移及预后息息相关，PTPRG⁃AS1 是上皮性卵巢癌总生存期和无病生存期的独立预后因素，其可作为该肿瘤的预后生物标志物［8］；非小细胞肺癌组织中PTPRG⁃AS1 表达上调，其通过靶向集合miR⁃200c⁃3p 上调转录因子4（transcription fac⁃tor 4，TCF4）的表达促进非小细胞肺癌细胞的活力和放射抗性［9］；骨肉瘤组织和细胞系中PTPRG⁃AS1表达上调，敲减PTPRG⁃AS1 降低了体外骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力，PTPRG⁃AS1 可能对骨肉瘤细胞转移具有促进作用［10］。本研究结果表明，PTPRG⁃AS1 在乳腺癌细胞系中表达上调，敲减PTPRG⁃AS1 的乳腺癌细胞增殖活性、迁移数及侵袭数均降低，说明敲减PTPRG⁃AS1 阻碍了乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，提示PTPRG⁃AS1 也可作为乳腺癌治疗的分子靶点。CyclinD1 参与调控细胞周期，其表达增加促进细胞增殖［11］。MMP2 和MMP9 是基质金属蛋白酶家族成员，可通过降解细胞外基质促进肿瘤细胞迁移及侵袭［12］。本研究结果表明，敲减PTPRG⁃AS1 降低了乳腺癌细胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达，这进一步说明敲减PTPRG⁃AS1 抑制了乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭。

为了进一步探究敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 阻碍乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制，本研究证实了LncRNA PTPRG⁃AS1 可靶向结合并负向地调控miR⁃5590⁃3p 的表达。miR⁃5590⁃3p 在多种肿瘤中异常表达。肾癌组织中miR⁃5590⁃3p 表达下调，上调miR⁃5590⁃3p 对肾癌细胞恶性行为具有显著抑制作用［13］；miR⁃5590⁃3p 表达的下调增强前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力，敲减miR⁃5590⁃3p有可能起到治疗前列腺癌的作用［14］；miR⁃5590⁃3p在胃癌中表达降低，上调miR⁃5590⁃3 通过靶向抑制RNA 解旋酶5（DEAD box helicase 5，DDX5）的表达降低了体外胃癌细胞的增殖及体内肿瘤生长，miR⁃5590⁃3p 对胃癌发展起抑制作用［15］。本研究结果显示，miR⁃5590⁃3p 在乳腺癌细胞系中的表达明显低于乳腺上皮细胞，过表达miR⁃5590⁃3p降低了乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭性，这与miR⁃5590⁃3p 在上述其他肿瘤中的研究结果一致，提示miR⁃5590⁃3p 在乳腺癌中也发挥抑癌基因作用，上调其表达有可能起到治疗乳腺癌的作用。此外，本研究结果还表明，敲减miR⁃5590⁃3p 逆转了敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的阻碍作用，这进一步提示敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 可能通过靶向上调来阻碍乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，但LncRNA PTPRG⁃AS1 具体调控的miR⁃5590⁃3p 的靶基因还有待进一步探究。

综上，乳腺癌细胞系中LncRNA PTPRG⁃AS1表达上调，而miR⁃5590⁃3p 表达下调；敲减LncRNA PTPRG⁃AS1 对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭发挥显著抑制作用，其可能通过靶向负调控miR⁃5590⁃3p 发挥作用，LncRNA PTPRG⁃AS1/miR⁃5590⁃3p 轴可能为乳腺癌的治疗提供了新靶点，但尚需进一步在体内研究LncRNA PTPRG⁃AS1/miR⁃5590⁃3p 轴对乳腺癌肿瘤发生发展的影响。