惠州地区亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性特征分析

钟泽艳 陈迪娜 杨坤祥 陈剑虹

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因位于1p36.3，是叶酸代谢的关键酶，可将5，10⁃亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5⁃甲基四氢叶酸，维持DNA 的稳定。大量研究表明，叶酸对孕妇尤其重要，叶酸摄入不足或不能被人体有效利用是导致新生儿出生缺陷和不良妊娠结局的主要原因［1⁃2］。叶酸在人体不能合成，受遗传、环境、生活习惯影响，我国人群叶酸缺乏率很高，现叶酸已被列为我国重大公共卫生服务项目之一。国内外多项研究发现，MTHFR基因存在多个基因多态性位点，其中MTHFR基因C677T（rs1801133，Ala222Val）是最常见的突变位点，其突变使MTHFR活性降低，影响叶酸正常代谢，而且不同基因型的人群代谢能力不同，补充的量也不一样［3⁃4］。本研究通过分析惠州地区育龄夫妇MTHFR基因C677T 位点多态性分布情况，为本地区育龄妇女根据自己的遗传体质，有效地补充叶酸量提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年6月至2019年12月到本院产前诊断中心就诊的孕前或孕期行优生健康检查育龄夫妇的样本共765 例。年龄为17～47 岁，平均年龄（29.56±4.96）岁。纳入标准：①年龄≥16 岁（刑法上16 岁开始承担完全的刑事责任）；②就诊的孕前或孕期行优生健康检查育龄夫妇，其中包括有过神经管畸形妊娠史或不明原因的流产、早产、畸形儿童或产死的女性。排除标准：患有遗传疾病或其他机体异常者。本研究获得本院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 主要仪器与试剂

采用Lab⁃Aid 824 全自动核酸提取仪（致善生物zeesan）、5430R 台式离心机（德国Eppendorf 公司）、7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）、Lab⁃Aid 824 核酸提取试剂盒（厦门致善生物科技股份有限公司）、亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T 检测试剂盒（PCR⁃荧光探针法，深圳奥萨制药有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集

对受检者进行详细的病史调查，内容包括疾病史、生育史、家族史、饮食情况、药物服用情况、行为习惯等。同时，抽取外周静脉血2 mL，使用乙二胺四乙酸二钾（EDTA⁃K2）抗凝，样本于4～8℃保存，一周内完成检测。

1.3.2 DNA 提取和基因多态性检测

采用Lab⁃Aid 824 全自动核酸提取仪和核酸提取试剂盒提取外周血基因组DNA，提取量为200 μL EDTA⁃K2抗凝外周血。采用厂家原装配套试剂和耗材，均严格按照仪器及试剂说明书操作。获得的DNA 应用深圳奥萨制药有限公司的亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T 检测试剂盒（PCR⁃荧光探针法）进行基因检测，按照操作说明书进行实验操作和结果判断。根据李杰等［5］的研究报道，MTHFR基因C677T 位点多态性分布与年龄及地域有相关性，参考之将年龄以30 岁为分界点，把基因型和等位基因频率的分布分为两组。

1.3.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行数据统计学分析；用Hardy⁃Weinberg 遗传平衡规律检验人群的分布特征。计数资料以n（%）表示，组间比较采用x2检验；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR 基因C677T 位点的基因型多态性结果

对惠州地区育龄夫妇MTHFR基因C677T 位点的基因型数据进行Hardy⁃Weinberg 遗传平衡检验，MTHFR基因C677T 位点符合Hardy⁃Weinberg遗传平衡，纳入对象有群体代表性（P=0.644）。检出野生型（CC）、杂合突变型（CT）和纯合突变型（TT）分别占54.12%（414 例）、38.43%（294 例）、7.45%（57 例）。见表1。

表1 惠州地区育龄夫妇MTHFR 基因C677T 位点的基因型分布［n（%）］Table 1 Genotype distribution of MTHFR C677T in couples of childbearing age in Huizhou［n（%）］

2.2 MTHFR 基因C677T 位点的等位基因频率分布结果

MTHFR基因C677T 位点的基因型频率中，突变T 基因频率为26.67%。见表2。

表2 不同种族人群MTHFR 基因C677T 的等位基因频数与频率分布［n（%）］Table 2 Allele frequency and frequency distribution of MTHFR C677T in different races［n（%）］

3 讨论

叶酸属于B 族维生素，参与维持细胞内正常甲基化和基因组稳定性，孕期缺乏会严重危害孕妇及胎儿健康。孕期叶酸缺乏不仅会造成新生儿神经管缺陷、唇腭裂、肛门闭锁、唐氏综合征和先天性心脏病等新生儿出生缺陷病，也是引起孕妇妊娠期贫血、高血压、自发性流产和早产的原因之一［6⁃7］。目前，叶酸增补已纳入我国出生缺陷项目中一级预防的主要措施之一，且在2017年《围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南》中明确指出，怀孕前三个月和孕期的前三个月每天服用一定量的叶酸来降低新生儿出生缺陷率［1］。因此，MTHFR基因C677T 的基因多态性检测，适用于育龄夫妇生育前预防性检测，及早发现围孕期妇女对叶酸的吸收利用水平，实现个性化增补叶酸，达到优生优育。

本研究收集惠州地区育龄夫妇样本中，不同年龄段的基因型和基因频率分布与总体的分布特征一致，均以野生型为主，依次为杂合突变型和纯合突变型，三者的占比约为7∶5∶1。研究结果符合千人基因组数据库（http：//asia.ensembl.org/in⁃dex.html）中东亚人群和中国南方汉人群的分布规律，基因型和等位基因频率结果分布显示一样的特征：基因型分布特征显示，惠州地区人群和中国南方汉人群差异性最小，与西双版纳傣族和北京汉族人群不同基因型和等位基因之间比较，差异有统计学意义，而与东亚人群基因型的分布比较，差异无统计学意义；等位基因频率分布结果显示，惠州地区人群等位基因频率分布和中国南方汉人群与东亚人差异无统计学意义，和西双版纳傣族与北京汉族人群差异有统计学意义。本研究人群TT 纯合突变型占比最低，比前期报道［8⁃14］的广东地区、赣南、遵义、云南、郑州中原区、陕西延安和苏州地区人群的该基因型所占比例均低。分析原因，惠州地区的人群主要以汉族客家人群为主，与其他地区民族人群存在一定的遗传异质性；其次，不同地区人群由于长期生活的环境和习惯不同，导致一定的遗传差异。此外，本研究纳入的样本量与其他研究的样本量存在较大的差异，会对结果的分析产生一定的影响。通过询问病史，相对于CC 野生型和CT 杂合突变型，TT纯合突变型人群的不良妊娠史，例如葡萄胎史、复发性流产史和先兆流产史等的概率更高，这与张运霖［15］报道的相一致。由于本研究纳入样本量有限，不同地区叶酸代谢障碍MTHFR基因C677T 位点多态性分布特征对不良妊娠史和不良出生缺陷的影响尚有待进一步行大样本、多中心的研究。

本研究表明惠州地区MTHFR基因C677T 的基因型与等位基因频率分布除了与广东地区比较，差异无统计学意义，与赣南、遵义、云南、郑州中原区、陕西延安和苏州地区的分布结果均存在一定的差异，且差异有统计学意义，并且呈现从南方到北方差异不断增大的趋势。分析原因可能与选择的地区人群以及所选的样本量有关，再次验证MTHFR基因C677T 位点的基因型和基因频率分布具有明显的地域和种族人群差异特征性。

综上，因不同基因型的人群叶酸代谢能力不同，补充的量不一样，根据妊娠史和基因检测结果，结合育龄期妇女的具体情况，给出科学的增补叶酸建议。特别是对MTHFR基因C677T 位点的CT 和TT 基因型妇女，应科学地个体化增加叶酸的补充量，有效降低不良妊娠史和不良出生结局的发生率。