抗阻运动对大鼠血清vWF含量及导管相关性血栓形成的实验研究

黄欣欣，应燕萍，蒋庆娟，韦佳妮，文 萃，赵慧函

广西医科大学第一附属医院，广西530021

1929年，德国外科医生Werner Forssman完成了世界上首例中心静脉置管术，开启了中心静脉导管(central venous catheter， CVC)的时代[1]。CVC是指经颈内静脉、锁骨下静脉或股静脉置入且尖端位于上、下腔静脉或右心房附近的细长、柔软中空导管[2]。每年都有上千万的CVC在全球医疗机构被应用于各类急危重症病人的支持与治疗[1]。尽管CVC优点众多，但也有着不可忽视的并发症，其中，导管相关性血栓(catheter related thrombosis，CRT)是其最常见的严重并发症之一。CRT被定义为CVC所在静脉处发展形成的血栓[3]，可导致深静脉血栓、肺栓塞以及血栓后综合征的发生，严重影响病人的生活质量，因此，有效预防CRT的形成至关重要。CRT主要与穿刺时或留置导管过程中刺激损伤血管内皮、血流动力学改变以及病人自身状态等因素有关[4]。血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一种由内皮细胞和巨核细胞合成分泌的多聚体糖蛋白且其分泌受血流动力学的调控，在内皮细胞损伤或受刺激时被大量释放至血液循环参与生理止血和血栓形成过程，被认为是有价值的内皮损伤与血栓形成标志物[5-6]。

美国静脉输液护理学会鼓励病人进行置管侧肢体的早期规律运动与锻炼以有效预防CRT形成，而非使用药物策略[7]。适度的物理运动被认为是一种有益的生理刺激，其通过增加局部血流量，加快血流速度，促进血管舒张等修复血管内皮损伤，保持内皮功能稳态以最小化血管并发症[8]。抗阻运动是指通过使肌肉收缩来对抗外部阻力，以达到肌肉质量增长，力量和骨密度增加的任何形式的运动，具有低能耗的特点[9]。临床研究证实，抗阻运动如握拳活动、握力器锻炼、抓握握力球等均能有效预防CRT的发生[10]。但目前关于抗阻运动预防CRT发生的分子机制的研究仍较少，本研究旨在通过构建CVC大鼠模型，进行4周抗阻运动干预后观察血栓形成情况，并测定血清vWF的含量，探讨抗阻运动预防CRT形成的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性SD大鼠60只，7～8周龄，体质量230～250 g，来源于广西医科大学实验动物中心(SCXK桂2020-0003)，由广西医科大学实验动物中心SPF级动物房代养(SYXK桂2020-0004)。环境温度控制在20～25 ℃，空气湿度为60%～70%，12 h光/暗循环，自由进食与饮水。实验所有过程遵循3R原则，且已获广西医科大学实验动物福利与伦理委员会审批。

1.2 主要仪器及试剂

硅胶导管与堵头(2#PU，北京思科诺斯生物科技有限公司)，实验动物爬梯(课题组自主研发，专利号：CN201921509747.4)，大鼠vWF酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：ml1003160-C)，10%中性甲醛(G2161，北京索莱宝科技有限公司)，伊红-苏木精染色(HE)染色试剂盒(G1120，北京索莱宝科技有限公司)，中性树脂(G8590，北京索莱宝科技有限公司)，恒温孵育箱(IGS180，美国Thermo Scientific公司)，酶标仪(SynergyH1，美国Bio Ted仪器有限公司)，数字切片扫描与应用系统(Nano Zoomer s60，日本滨松光子学株式会社)，石蜡包埋机(Histo Core Arcadia H，德国LEICA公司)，切片机(Histo Core BIOCUT，德国LEICA公司)。

1.3 实验动物分组

全部大鼠均进行7 d的无负重适应性爬梯训练，完成预爬的大鼠被纳入实验，否则予以剔除。按照随机分组原则，将大鼠分到空白组、假手术组、置管术组、置管术+抗阻运动组，每组15只。空白组大鼠不予任何处理，正常饲养；假手术组行假手术后，正常饲养；置管术组行置管术，正常饲养；置管术+抗阻运动组行中心静脉置管术后第1天进行抗阻运动干预。

1.4 实验方法

1.4.1 置管方法

基于课题组前期研究[11]并借鉴宋文煜等[12]小鼠颈静脉置管经验进行造模。3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)[13]经腹腔注射给药麻醉大鼠至理想状态，取仰卧位，固定后行备皮、消毒和铺巾，颈前正中线右外0.5 cm处做一长约1 cm纵向切口，钝性分离皮下组织与肌肉，充分暴露与游离出右颈外静脉。在近心端和远心端血管下方分别放置4-0缝线，在静脉上做“V”型切口并置入导管，回抽见回血后推注生理盐水，堵头封闭导管末端，缝线固定导管后进行逐层缝合，消毒伤口并清除周围血迹。取暖器保温，促使大鼠复苏，观察至清醒后放回鼠笼。

1.4.2 假手术方法

假手术即置入导管至理想位置后拔出，不予留置导管于大鼠体内，压迫止血后逐层缝合，取暖器保温、促使大鼠复苏，观察至清醒后放回鼠笼。

1.4.3 抗阻运动方案

参照大鼠抗阻运动模型[14]适当修改干预方案，置管术后第1天利用实验动物爬梯[15]进行抗阻运动干预。采用大鼠尾部砝码负重的方式，第1周负重量为体质量的10%，第2周、第3周、第4周分别负重体质量的30%、50%和70%，频次为4次/组，间隔每次1 min，每天2组，每周5 d，共4周。大鼠从爬梯底部爬至顶部，必要时可通过刺激鼠尾诱导其进行爬梯运动，具体干预方案见表1。

表1 抗阻运动干预方案

1.4.4 标本采集

末次抗阻运动结束当天完成所有大鼠取材工作，3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)麻醉后解剖大鼠，经腹主动脉采血3 mL，室温放置2 h后在4 ℃，1 000 r/min条件下离心10 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱待测。取下导管所在静脉组织段浸泡于10%甲醛固定液中。

1.5 指标评估

1.5.1 血栓形成情况

取下的血管组织于10%甲醛固定48 h，经程序性脱水、石蜡包埋、组织切片、HE染色和中性树脂封片等步骤后，扫片仪40×倍镜下扫片，观察血栓形成情况，Image-Pro Plus 6.0软件计算血栓面积百分比(血栓面积百分比=血栓面积 /血管腔横截面积 ×100)。

1.5.2 血清vWF含量测定

使用ELISA试剂盒检测大鼠血清vWF含量，所有步骤均根据试剂盒说明书严格执行。酶标仪建立标准曲线并检测450 nm处吸光度值，计算vWF含量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 基本情况

所有大鼠置管均为一次成功，成功率为100%；导管留置期间大鼠未出现出血、感染以及死亡等情况，存活率为100%。干预前各组大鼠体质量均衡可比，差异无统计学意义(P>0.05)。抗阻运动干预第1周至第3周，各组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)，第4周干预结束时，置管术+抗阻运动组大鼠体质量较置管术组更轻，差异有统计学意义(P<0.001)，详见表2。

表2 各组大鼠体质量变化情况比较 单位：g

2.2 血栓形成情况

大鼠血栓形成情况见表3，HE染色结果见图1。

图1 光镜下血栓形态图(HE染色，40×倍镜，500 μm)(A为空白组；B为假手术组；C为置管术组；D为置管术+抗阻运动组)

2.3 大鼠血清vWF含量(见表4)

表4 各组大鼠血清vWF含量比较 单位：ng/mL

3 讨论

根据魏尔啸提出的血栓形成“三要素”理论[16]可知，血管内皮损伤、血液缓滞以及血液高凝状态是导致血栓发生的主要病因，也是促使CRT高发的原因。在不同研究中CRT发生率不尽相同，这可能与研究方法、研究对象和诊断方法等不同有关。有研究统计，症状性血栓发生率为6.7%[17]，而无症状性CRT占比高至68.0%[18]，由此可见CRT具有高发而隐匿的特点。CRT的主要预防策略包括药物和物理干预，但现有指南与文献不建议药物抗凝作为CRT的一级预防策略。而运动可以通过加快血流速度、介导血管舒张、调控血液中凝血活性物质以及改变血液流变学，如提高血流对静脉管壁的剪切应力从而预防血栓事件的发生[19]。相比而言，物理运动具有不增加病人出血风险、安全、经济、易于推广等优点。

在本研究中，空白组大鼠无血栓形成，假手术组和置管术组大鼠CRT发生率分别为33.33%和80.00%，置管术+抗阻运动组大鼠经过4周抗阻运动干预后CRT发生率为13.33%，置管术+抗阻运动组与置管术组相比，差异有统计学意义(P<0.001)；而置管术+抗阻运动组与空白组比较，CRT发生率差异无统计学意义(P>0.05)。此外，对各组大鼠的平均血栓面积比较也得到了同样的趋势，置管术+抗阻运动组大鼠的平均血栓面积为4.79%，低于置管术组。因此，本研究结果证实了抗阻运动有利于预防和减少CRT的发生。导管置入过程必然伴随着血管内皮的损伤，CRT是血管壁创伤后不可避免的事件[20]。虽然导管置入会导致血管内皮损伤，但通过假手术组(CRT发生率33.33%)和置管术组(CRT发生率80.00%)的比较可知，假手术组大鼠血栓形成明显少于置管术组(P<0.05)。提示，静脉穿刺虽然会引起血管内皮的损伤，但长期留置导管对血管壁产生的刺激才是引起内皮损伤的主要原因。同时，导管的存在占据了一定的血管腔体积导致血流减缓，有研究显示，导管直径与血管直径比值越小即导管占据血管腔体积越大，血液淤滞越严重，越有利于CRT形成[21]。

完整的血管内皮对于血管功能稳态的维持至关重要，是发挥抗血栓、调节血管张力以及免疫调节等功能的前提。vWF与血管内皮损伤和血栓的形成有关，被认为是有价值的判断血管内皮损伤程度和血栓风险标志物，由内皮细胞与巨核细胞合成并被储存于内皮细胞中的韦伯小体和血小板中。vWF通过诱导血小板黏附、聚集至内皮损伤处，并激活血小板启动凝血级联；作为载体与Ⅷ因子结合，延长其半衰周期；促使纤维蛋白原生成这3条途径共同促使血栓形成[22]。临床研究发现，vWF在深静脉血栓形成病人和健康人中差异性表达，深静脉血栓病人vWF血浆浓度高于健康人(P<0.05)[23]，脑梗死病人血清vWF水平也较健康人更高[24]。CVC穿刺过程中血管内皮局部损伤，凝血和炎症反应级联被激活，而运动能降低内皮氧化应激损伤和减少促炎性因子的表达，从而促使血管内皮损伤修复[25]，减少血栓的形成。本研究结果显示，与空白组相比，假手术组和置管术组大鼠血清vWF含量增加(P<0.05)；经过运动干预后，置管术+抗阻运动组大鼠血清vWF含量低于置管术组[(423.48±99.99)ng/mL与(205.71±83.77)ng/mL，P<0.001]，与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。进一步证实血管内皮损伤会导致vWF释放增多，促使CRT的形成，也证实了抗阻运动能够促使血管内皮损伤修复，减少vWF分泌，从而达到预防CRT形成的目的。

4 小结

抗阻运动能有效预防导管相关性血栓的发生，可降低导管相关性血栓的发生率和平均血栓面积百分比，其机制可能是减轻与修复内皮损伤、减少内皮细胞释放vWF，从而减少血小板的黏附与聚集，最终预防血栓的形成。