CEACAM5在肺腺癌中的表达及临床意义

刘传 李丽娟 王嵘 汤兵祥

肺癌是一种由支气管黏膜或腺体引发的常见恶性肿瘤，临床症状表现为干咳、胸痛、气急等。恶性肿瘤具有侵袭周围组织和转移到远处器官的能力，最终会导致肿瘤治疗失败[1]。在恶性肿瘤中，肺癌发病率及死亡率居于首位[2]，且呈上升趋势，全球肺癌患者5年生存率为10%-15%，在中国仅5.5%左右[3]，严重危害人类健康。癌胚抗原相关细胞黏附分子5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)属于免疫球蛋白CEACAMs家族，有研究证实CEACAMs家族在恶性肿瘤中有重要的检测价值，比如，CEACAM5 mRNA双标记的循环肿瘤细胞(CTCs)提示乳腺癌患者预后不良[4]，食管腺癌患者CEACAM1高表达[5]。目前关于CEACAM5基因在肺腺癌中的表达研究较少，有关肺腺癌发生机制尚不明确，本研究采用免疫组化法检测肺腺癌患者中CEACAM5基因表达情况，并利用Ualcan数据库(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)分析CEACAM5在肺腺癌中的表达情况以及和预后的关系，探究CEACAM5和肺腺癌中的关系和临床学意义，为进一步探索肺腺癌发生发展的分子机制奠定基础。

资料与方法

一、一般资料

1 经本院医学伦理委员会讨论后批准，选择2016年8月-2017年8月在本院确诊为肺腺癌的患者51例，取肺腺癌患者病变肺部组织作为实验组；从中随机选取42例，取癌旁组织作为对照组。本组所有患者均符合肺腺癌的国际多学科新分类方案中诊断标准[6]。纳入标准：① 确诊为肺腺癌；② 临床病理资料完整；③ 无明显肝肾功能损坏；④ 患者及家属知情并自愿参加此次研究。排除标准：① 因其他原因中途停止参与者；② 具有恶性肿瘤史及其他部位原发肿瘤者；③ 曾接受放疗、化疗、免疫治疗。术后对所有患者进行3年随访，每3-6个月通过电话或门诊进行随访，截至患者死亡或随访至2020年2月，期间无失访案例。

2 主要试剂与仪器

鼠抗人CEACAM5单克隆抗体(货号：MAB3848)，艾美捷科技有限公司；SP试剂盒(货号：XY-SP-Hu)，上海信裕生物科技公司；DAB显色剂(货号：CTS010)，上海嵘葳达实业有限公司。

二、实验方法

1 取材及免疫组化检测

手术中取受试者的肺腺癌组织和癌旁组织，将肺腺癌组织和癌旁组织均切成2～3微米切片，先用10%福尔马林溶液固定，经常规石蜡包埋制成4 μm厚切片备用。采用免疫组织化学染色法检测CEACAM5蛋白表达水平，染色方法严格按照试剂盒说明书进行操作，酒精脱蜡，PBS冲洗3次，梯度酒精水化，然后在枸橼酸盐缓冲液(0.01 M，PH6.0)中加热20 min修复抗原，PBS冲洗切片3次；晾干后滴加5%山羊血清蛋白孵育30 min；加抗体，4 ℃孵育12 h；复温90 min，PBS清洗后加二抗，39 ℃环境下孵育25 min，然后用PBS清洗3次；(4)采用DAB显色剂染色，苏木素复染、显色后，自来水冲洗，二甲苯固定3次，每次5 min，风干后封片，并将处理好的切片在光学显微镜下观察，每张切片随机选取5个400倍镜视野进行阳性细胞计数。

2 染色及判定标准

CEACAM5阳性为细胞膜以内细胞核以外出现颗粒状棕黄色，判定标准是细胞染色百分比及染色程度。按染色程度评分：基本无色(0分)，浅黄色(1分)，深黄色(2分)，褐色(3分)；按阳性细胞染色百分比评分：阴性(0分)，25%以下(1分)，25%-50%(2分)，50%以上(3分)。免疫组化评分(染色程度评分×阳性细胞百分率评分)为最终评分：≤1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为阳性()，>6分为强阳性()，定义阴性组包含阴性和弱阳性，阳性组包含阳性和强阳性。

三、统计学方法

用SPSS 23.0对数据统计，计数资料以率表示，行卡方检验；计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验；采用UALCAN数据库分析肺腺癌中CEACAM5的表达与性别、年龄、吸烟史之间的关系以及预后情况；采用Kaplan-Meier生存曲线对肺腺癌患者进行生存分析，并分析肺腺癌中CEACAM5与CEACAM6、CEACAM1相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料比较

实验组和对照组性别、年龄、吸烟史、临床分期等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)所示。

表1 一般资料比较

二、Ualcan数据库分析CEACAM5在肺腺癌中的表达

Ualcan数据库显示，CEACAM5在肺腺癌组织中的表达高于正常组织(P<0.05)；CEACAM5在正常组织中表达水平低于患肺腺癌男性患者、女性患者(P<0.05)；CEACAM5在正常组织中表达水平低于≥41岁的肺腺癌患者(P<0.05)；CEACAM5在正常组织中表达水平低于肺腺癌各临床分期的表达水平(P<0.05)(见图1)。

三、两组中CEACAM5的表达及与肺腺癌临床病理特征的关系

实验组CEACAM5阳性表达率62.75%(32/51)高于对照组阳性表达率21.43%(9/42)(χ2=15.950，P<0.001)(见图2)。其中CEACAM5阳性组在年龄、临床分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度、肿瘤大小与阴性组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而阳性组和阴性组性别上差异无统计学意义(P>0.05)( 见表2)。

表2 CEACAM5表达和肺腺癌临床病理特征的关系[n(%)]

四、CEACAM5与肺腺癌预后的关系

根据Ualcan数据库分析，肺腺癌CEACAM5高表达者126例，中低表达者376例，比较高、低表达者的远期生存状况，结果显示CEACAM5高表达的肺腺癌患者远期生存率与低表达患者相比差异无统计学意义(P=0.53)。见图3A。而本研究根据Kaplan-Meier生存曲线分析肺腺癌患者3年生存率，CEACAM5阳性表达患者生存率50.0%(16/32)低于阴性表达生存率78.9%(15/19)，两组比较log-rank值为4.324，P=0.038。见图3B。同时经COX回归分析显示，CEACAM5及临床分期、淋巴结转移均是影响肺腺癌预后的危险因素(见表3)。

图3 CEACAM5表达与肺腺癌预后的关系

五、CEACAM5与CEACAM6、CEACAM1相关性分析

应用Pearson相关性分析，发现CEACAM5与CEACAM6、CEACAM1存在明显的相关性(r=0.48，0.43，P<0.05)(见图4)。

图4 肺腺癌中基因CEACAM5与CEACAM6、

讨 论

肺腺癌病情发展缓慢，恶性程度低，但因为存在微转移灶，使其向血管和淋巴等转移，发现时已是癌症中晚期[7]。从1965年至今，CEACAM5在各种癌症中的研究逐渐增多，比如呼吸道、胃肠道以及乳腺肿瘤等，CEACAM5在恶性肿瘤中至关重要。有研究表明，CEACAM5在肿瘤细胞分化、增殖过程中起调节作用，高表达CEACAM5使细胞极性和正常组织结构遭到破坏，影响细胞的分化成熟，其抗失调凋亡的功能，制约着恶性肿瘤的分化和侵袭[8-9]。但CEACAM5和肺腺癌的研究较少，因此探寻CEACAM 5与肺腺癌关系及发病机制至关重要。

CEACAM5是哺乳动物免疫球蛋白家族的糖蛋白之一，通过与同源性蛋白以及异源性蛋白相互作用调节细胞粘着性，对细胞识别有重要作用[10]。冯世兵[10]研究CEACAM5在胃良恶性病变中的表达时指出，CEACAM5在正常胃黏膜上皮中不表达，在胃良性和恶性病变患者的细胞膜或细胞质中表达，且细胞膜与细胞质混合表达增加。此外，CEACAM5在肿瘤细胞的细胞膜和细胞质表达，分别代表着癌前病变以及肿瘤侵袭和转移，胃癌前病变的标志物是膜染色，是良恶性的标志[10]。本研究数据显示肺腺癌患者癌组织中CEACAM5阳性率比癌旁组织高，和Ualcan数据库分析的结果一致，表明CEACAM5可能参与肺腺癌的发生发展。CEACAM5是人类组织和肿瘤细胞分化及增殖的重要调节分子，CEACAM5 在结、直肠癌样本中高表达，与结、直肠癌病程进展密切相关，可作为结直肠癌肝转移早期复发的预测标志[9，11]。CEACAM5表达量的升高可能说明恶性程度严重、侵袭能力强、转移率高、预后性差[12]。有研究比较了乳腺癌治疗前后CEACAM5mRNA CT值水平变化与预后的关系,发现治疗后CEACAM5 mRNA降低的患者预后要优于未降低[4]。本研究结果显示CEACAM5阳性表达患者的3年生存率低于阴性患者，同时经COX回归分析显示，CEACAM5及临床分期、淋巴结转移均是影响肺腺癌预后的危险因素，提示CEACAM5阳性表达可能是肺腺癌患者预后不良的影响因素。而单因素分析显示年龄及肿瘤大小是影响患者预后的相关因素，而经多因素分析显示并非影响预后的危险因素，与虞林湘等[13]研究相似，但也可能受研究对象较少而影响结果准确性，因此仍有待扩大样本进一步明确相关危险因素。Ualcan数据库分析显示，CEACAM5高、低表达患者远期生存率差异无统计学意义，与本研究结果不一致，可能是因为本研究随访时间较短，样本量较少，从而导致研究结果存在差异。

CEACAM1是免疫球蛋白超家族成员之一，亦是一种抑制肿瘤的蛋白，通过提升表达量，维持上皮细胞正常基因型，应对肿瘤病发[14]。CEACAM1已被证实参与调节接触依赖性肿瘤免疫反应。以往研究表明，CEACAM1在胃癌及口腔癌血管生成中起重要作用。CEACAM1在食管腺癌组织中表达水平明显增高,其表达与食管腺癌患者病理分化与分期及预后有关,表明CEACAM1可能是食管癌的新靶点[5]。CEACAM6属于细胞表面糖蛋白，经糖基磷脂酰肌醇固定在细胞膜上，在致癌因子刺激下，CEACAM6表达升高，使肿瘤细胞增殖、活性提高[15]。有研究认为CEACAM6肿瘤中高表达与耐受失巢凋亡现象相关[16]。Ualcan数据库分析显示，CEACAM5和CEACAM6、CEACAM1在肺腺癌中均呈正相关，可能是CEACAM5、CEACAM1、CEACAM6在肺腺癌中有协同作用，共同参与调控肺腺癌的发生发展，说明CEACAMs家族在致癌机制上可能存在一定联系；通过进一步分析显示，CEACAMs家族中 CEACAM分子均是连接在细胞膜上的，其中CEACAM5和CEACAM6以及CEACAM7主要是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)与细胞膜连接的，而CEACAM1主要是通过疏水的跨膜结构连接在细胞膜上的，其配体可能和GPI连接分子的相互作用，或通过CEACAM1的跨膜结构域将信号传入细胞内[17]，但是由于目前关于各个分子的生物学功能是否存在受体复合体系统目前尚不明确，因此CEA基因家族在肿瘤的发生发展及转移中扮演的角色还需要进一步研究。

综上所述，肺腺癌患者癌组织CEACAM5阳性率高于癌旁组织，CEACAM5与CEACAM6、CEACAM1存在明显的相关性，CEACAM5表达与肺腺癌患者预后密切相关，可能是治疗肺腺癌的潜在靶点。但是由于肺腺癌发生机制尚不清楚，且本研究选取样本数量较少，未选取健康对照及良性病变组进行鉴别分析等诸多不足之处，同时关于其CEACAM5对肺腺癌患者的诊断及预后评估价值尚未进行分析，导致本研究不能准确反映CEACAM5与肺腺癌确切关系，还有待进一步研究。