哮喘控制水平、肺功能下降与诱导痰IL-6表达水平的相关性分析

杨婧 王婷 祝阿妮

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症为特征的异质性疾病[1-2]。这种气道炎症导致气道高反应性，故支气管哮喘常出现广泛、多变的可逆性呼气气流受限，患者反复发作喘息、胸闷、咳嗽等症状，若诊疗不规范，症状控制不佳，会严重影响患者生活质量[3]。IL-6作为IL家族中常见的一员，是由免疫系统细胞分泌的小分子糖蛋白(21 kDa)[4]，其释放常由细胞应激或损伤因素触发，如紫外线、辐射等。IL-6也因在多种炎性疾病中高表达，故一直以来被认为是炎症的一个常见标记物[5]。既往研究也发现IL-6在哮喘患者血清中高表达。本研究纳入处于不同控制水平的支气管哮喘患者，测定并对比诱导痰IL-6的表达水平，探究哮喘控制水平、FEV1值与诱导痰IL-6表达水平的相关性。

资料与方法

一、研究对象

研究纳入了2019年1月至2020年12月就诊于我院门诊的哮喘患者159例，其中哮喘控制良好组患者42例，哮喘部分控制组患者49例，哮喘未控制组患者68例。研究前纳入的病例中排除了12例中重度及8例危重度哮喘患者。纳入标准：诊断标准参考第九版内科学哮喘诊断标准：① 反复发作性喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽，多与接触变应原、冷空气、物理、化学性刺激、病毒性上呼吸道感染、运动，有关。② 发作时在双肺可闻及散在或弥漫性以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长。③ 上述症状可经治疗缓解或自行缓解。④ 症状不典型者(如无明显喘息或体症)至少以下一项试验阳性：支气管舒张试验阳性；支气管激发试验或运动试验阳性；最大呼气量(PEF)日内变异率或昼夜波动率≥20%.⑤ 除外其他疾病引起的喘息、胸闷、咳嗽，如慢性支气管炎、阻塞性肺气肿、支气管扩张、肺间质纤维化、急性左心衰等。哮喘控制水平分级，参照第九版内科学哮喘症状控制水平表。过去四周，病人存在以下四条中的3-4项定义为未控制：① 日间哮喘症状>2次/周；② 夜间因哮喘憋醒；③ 使用缓解药次数>2次/周；④ 哮喘引起的活动受限。若出现1-2项定义为部分控制，若无上述症状定义为良好控制。排除标准：① 中重度及危重度哮喘患者。哮喘急性发作时严重程度分级参考第9版内科学，主要依据患者症状(气短程度、讲话是否有中断等)、体征(三凹征、奇脉等)及血气分析、肺功能检查等指标。② FEV1/预计值 < 50%。③ 近期大咯血患者。④ 呼吸衰竭。⑤ 气胸或纵隔气肿。⑥合并胸腔积液或心包积液。⑦严重心功能不全。⑧活动性肺结核。纳入及排除流程图(如图1)所示。患者的一般信息如性别、年龄、肺功能检查结果等数据来源于门诊或住院病历。研究所有参与者均被告知实验的研究目的及确切的实验程序。

图1 患者纳入及排除流程图

二、诱导痰法

在接受诱导痰前30分钟，所有患者均吸入200 ug沙丁胺醇，15分钟后，完成吸入支气管扩张剂后，肺功能检查。然后，每位患者均在室温下使用超声雾化器吸入无菌高渗性生理盐水，共吸入3次，浓度递增，分别为3%，4%和5%，每次吸入持续时间为5分钟，在咳出足够数量的痰(2 mL)后停止诱导。每次吸入后均测定患者FEV1水平，整个诱导痰过程顺利，未出现患者FEV1下降超过10%的情况。

痰液收集好后立即置于EP管中封存，称重，记录每管中痰液的重量和体积。在每例标本中均加入2倍痰重量的0.1% DTT溶液(德国merck)，后将混合物离心(1 000 rpm，15 min)。随后在每例标本中加入2倍痰体积的PBS溶液，再次将混合物离心(800 rpm，5 min)。收集上清液，储存于-80 ℃冰箱保存。诱导痰合格标准为：体积至少2 mL，上皮细胞小于50%，非上皮细胞大于200个。

测定IL-6时，受限进行标本分装，每个EP管留存100 ul痰标本。使用ELISA试剂盒(Abcam中国，ab178013)对每例标本进行IL-6表达值测定，所有步骤严格按照说明书操作。每例标本设有2组对照，试剂盒测试灵敏度为1.6 pg/mL，测定范围为7.8～500 pg/mL。

三、数据处理

采用Excel表格记录数据，用SPSS 22.0分析数据；计量资料，如年龄、IL-6表达值、FEV1值，以均数±标准差表示，对于符合正态分布的计量资料，采用单因素方差分析三组数据差异，进行两两组间比较时，使用单因素方差分析LSD进行多重检验比较；计数资料，如性别，以例数和百分比(%)表示，采用四格表卡方检验比较两组数据差异。在四格表中，若预期病例很少(<1)，则使用Fisher精确分析法分析。对于不符合正态分布的资料，采用秩和检验分析数据。以P<0.05视为有统计学差异。使用GraphPad prism 8.0绘制每组IL-6表达值的散点图、进行每组内FEV1与IL-6表达水平一元线性相关分析、绘制线形图。

结 果

一、一般信息

三组哮喘患者的一般信息由(表1)列出。在哮喘控制良好组，男性23例，女性19例；哮喘部分控制组，男性26例，女性23例；哮喘未控制组，男性36例，女性32例，三组在性别分布上无统计学差异(P>0.05)。三组平均年龄分别为(45.88±13.21)岁、(49.79±11.87)岁和(45.88±13.21)岁，无统计学差异(P>0.05)。从三组患者统计的肺功能指标上来看，FEV1值、FEV1%预计值、FEV1/FVC比值在哮喘控制良好组最高，哮喘部分控制组次之，哮喘未控制组最低，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表1)。

表1 三组哮喘患者的一般信息

二、三组哮喘患者诱导痰中IL-6表达情况

如表2所示，处于哮喘良好控制水平组患者诱导痰中IL-6表达值为(17.8±1.5)pg/mL，低于处于哮喘部分控制水平组患者(30.2±1.7)pg/mL和哮喘未控制水平组患者表达值(32.3±1.5)pg/mL。两两对比后发现，后两组表达值无统计学差异。三组IL-6表达值绘制的散点图(如图2)所示。

表2 三组哮喘患者诱导痰IL-6表达水平

图2 三组哮喘患者诱导痰IL-6表达水平散点图

三、肺功能(FEV1、FEV1%预计值、FEV1/FVC)与诱导痰中IL-6表达相关性分析

相关性分析可见(如图3)。在每组中，FEV1、FEV1%预计值、FEV1/FVC与诱导痰IL-6水均呈负相关，即诱导痰IL-6水平越高的患者FEV1、FEV1%预计值、FEV1/FVC值越低。

图3 各组FEV1、FEV1%预计值、FEV1/FVC 与诱导痰IL-6表达水平线性相关图。

讨 论

支气管哮喘(哮喘)是一种慢性非特异性炎症性气道疾病，伴有气道黏膜中多种炎性细胞浸润以及促炎细胞因子和脂质介质释放。因哮喘的炎症反应涉及多种不同的特异性免疫细胞和结构细胞，故哮喘存在疾病异质性[6]。大多数哮喘患者包括至少50%重症哮喘患者为2型气道炎症。2型气道炎症通常表现为嗜酸性粒细胞或FeNO升高，或可能伴有特异性(IgE升高)[7]，对吸入性激素反应良好，但重症哮喘对高剂量吸入性激素未必有效，因口服激素副作用大，故对于此类患者，针对IL-4、IL-5、IL-13等炎症因子及IgE为靶向的精准医疗，显得尤为重要[8]。

IL-6是由免疫系统细胞产生的小分子糖蛋白，是白介素家族中重要的一员。IL-6长期以来一直被认为和TNFα、IL-1β一样，是炎症的重要标记物。然而，越来越多的研究发现，IL-6不仅是促进炎症反应的因子，而且也是包括类风湿性关节炎在内的某些疾病的致病因素，故而已成为治疗某些疾病的靶点[9]。在哮喘的相关研究中，IL-6被证实在患者的血清中表达升高。与稳定期哮喘患者、健康的非吸烟者及接受机械通气的非哮喘患者相比，“活动性”的哮喘患者支气管肺泡灌洗液中的IL-6表达水平升高，提示IL-6可能参与哮喘的急性发作[10]。在我们的研究中，经测定诱导痰中IL-6的表达值后发现，与哮喘控制良好组患者相比，哮喘部分控制组和哮喘未控制组患者诱导痰IL-6表达值明显升高，这一结果也证实IL-6参与哮喘的“活动”。Zala Jevnikar等学者研究测定了18例轻中症哮喘患者(实验组)和16例健康者(对照组)诱导痰中几种炎症因子的表达水平，结果显示：IL-6在实验组中表达升高，而IL-4、IL-5表达在两组无明显差异，这提示可能存在除炎症细胞之外的其他促进IL-6分泌的细胞存在[11]。有研究证实，哮喘患者(成人和儿童)支气管上皮细胞中IL-6过度表达，裸鼠肺上皮细胞存在IL-6基因持续表达，若裸鼠暴露于过敏原，则IL-6基因则被激活表达，故IL-6在处于未控制水平的哮喘患者中高表达，可能不是持续炎症反应的结果，而是肺上皮细胞暴露于过敏原而被“激活”有关[12-13]。

我们的研究进一步统计，分析了每组中患者肺功能水平与诱导痰IL-6表达值相关性，结果发现，在每组中，FEV1、FEV1%预计值、FEV1/FVC与诱导痰IL-6水平均呈负相关，即诱导痰IL-6水平越高的患者FEV1、FEV1%预计值、FEV1/FVC值越低，P<0.05。在Zala Jevnikar等学者研究中，在轻中症哮喘患者中，诱导痰IL-6水平与FEV1/FVC%预计值呈负相关[11]。在Turan等人的研究中，哮喘患者IL-6水平与FEV1、FEV1/FVC呈负相关(P<0.05)，虽然P值>0.05，但也与FEV1%预计值有负相关趋势，均与我们的研究结果有一致性[14]。除了调节CD4+T淋巴细胞功能外，IL-6还被证实可以有促进气道壁增厚、上皮下纤维化、平滑肌细胞肥大和增殖的功能，IL-6可能通过上述功能介导气道重塑影响肺生理学功能[15-16]。

我们的研究证实哮喘患者诱导痰IL-6水平升高可能提示患者哮喘控制不佳，肺功能下降，IL-6以后期望成为哮喘治疗的生物学靶点。