HPLC法测定牙膏中厚朴酚与和厚朴酚含量前处理方法的优化

管弋铦 韩和平 李利伟

(重庆登康口腔护理用品股份有限公司，重庆 400025)

引言

厚朴作为中国重点保护的珍稀药材，其主要活性成分为厚朴酚与和厚朴酚。厚朴酚与和厚朴酚具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗氧化等广谱性生物活性，使厚朴提取物在口腔护理用品中逐渐得到应用[1,2]。目前，关于厚朴酚的含量测定多集中于中药制剂方面[3,4]，而口腔护理产品中厚朴酚含量的分析鲜有报道，且关于牙膏中厚朴酚与和厚朴酚含量测定的最优前处理条件的研究尚未见报道。

本研究采用高效液相色谱法(HPLC)对牙膏中厚朴酚与和厚朴酚进行前处理方法优化，通过单因素分析法对提取溶剂、甲醇浓度、料液比、振荡提取时间和超声时间5个影响因素进行考察，以期提供一种准确度高、检测效率快的牙膏中厚朴酚与和厚朴酚含量的检测方法。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

甲醇、乙腈(沃凯，色谱纯)，甲酸(川东化工，分析纯)，水为实验室纯水机制备的一级水，厚朴酚对照品与和厚朴酚对照品均购自上海源叶生物。

两年来，公司党委认真学习贯彻上级党组织的重要精神和决策部署，以“着力四个自信、聚焦三抓三要、巩固双基建设”为工作思路，理直气壮抓党建，为生产经营任务的完成提供了强有力的政治和组织保障。2017年以来，公司产量利润双创新高，不少集体和个人荣获昆明市劳动模范、云南省五一劳动奖章、五一巾帼标兵，云南省工人先锋号、上级公司优秀党员，优秀党务工作者、先进基层党组织等荣誉。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(1290 Infinity Ⅱ，安捷伦)；Welch Ultimate XB-C18色谱柱( 4.6mm×250mm，5μm) 、电子天平 ( ME204，梅特勒托利多) 、超声清洗器(GT-SONIC-D9，固特) 、超纯水系统( 1810A，摩尔)。

2 实验方法与结果

称取1g(精确至0.0001g)牙膏样品于20mL玻璃取样瓶中，加玻璃珠数颗，用移液管分别按料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15加入4、6、8、10、15mL 90%甲醇，在转速1800r/min条件下振荡提取15min，超声30min，冷却至室温后提取液过0.22μm有机相滤膜，滤液上机检测，结果见表4。当料液比达到1∶10后结果变化较小。与1∶15相比，1∶10的料液比经济效益更高，故综合考虑选择料液比为1∶10。

2.1 液相色谱条件

建筑给排水工程施工结束后，应及时对管道的清洁性、保温性以及防腐性进行检查，防止给排水工程出现因高温及腐蚀等因素影响管道正常运行。同时，在整个安装工程结束之后，还应该对排水系统进行适当的调整和验收，检测整个安装质量是否合格。

2.2 提取溶剂的筛选

称取1g(精确至0.0001g)牙膏样品于20mL玻璃取样瓶中，加玻璃珠数颗，用移液管加入10mL 90%甲醇，在转速1800r/min条件下分别振荡提取2min、5min、8min、10min、15min、20min，超声30min，冷却至室温后提取液过0.22μm有机相滤膜，滤液上机检测。如表3所示，振荡提取15min以上，样品分散彻底、提取效果较好，与20min相比，振荡15min效率更高。因此，综合考量选取振荡提取时间为15min。

表1 不同提取溶剂对厚朴酚和和厚朴酚提取的比较

2.3 甲醇浓度的筛选

称取1g(精确至0.0001g)牙膏样品于20mL玻璃取样瓶中，加玻璃珠数颗，用移液管加入10mL 90%甲醇，在转速1800r/min条件下振荡提取15min，分别超声0min、10min、20min、30min、40min、60min，冷却至室温后提取液过0.22μm有机相滤膜，滤液上机检测，其结果如表5所示。当超声时间大于20min后提取效果提升不明显，但预实验中某些特殊牙膏提取时，超声时间不足会造成分散不充分，综合考量选择超声时间为30min。

表2 甲醇浓度对厚朴酚与和厚朴酚提取的影响

2.4 振荡提取时间的筛选

称取1g(精确至0.0001g)牙膏样品于20mL玻璃取样瓶中，加玻璃珠数颗，用移液管分别加入10mL甲醇、乙醇、乙腈及水，在转速1800r/min条件下常温振荡提取15min，超声30min，冷却至室温后提取液过0.22μm有机相滤膜，滤液上机检测。不同提取溶剂对牙膏中厚朴酚与和厚朴酚提取效果的影响结果如表1所示，提取效果分别是甲醇>乙醇>水>乙腈。

(2)冷源中有2台吸收式溴化锂机组，蒸汽来源为3台3.9/h的燃油蒸汽锅炉，和直燃型溴化锂制冷机组相比，锅炉转换效率、热力管网两部分损失增大，整个冷源系统的效率明显下降；

表3 振荡提取时间对厚朴酚与和厚朴酚提取的影响

2.5 料液比的筛选

本研究采用单因素分析法考察提取溶剂、甲醇浓度、料液比 、振荡提取时间和超声时间5个因素对厚朴酚与和厚朴酚含量检测的影响，从而选出最优前处理条件。由于上述5因素分别来源于溶剂、时间、设备，彼此互不相容，设备之间原理不同且独立工作，不存在交互作用，可用单因素实验法筛选，以确定前处理最优方法。

依据预实验结果确定了液相色谱分析条件为Welch Ultimate XB-C18色谱柱( 4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈∶0.1 %甲酸溶液=52∶48(V/V)；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为294nm，参比波长450nm；进样体积为10μL。在此条件下空白对照样品、对照品和含厚朴酚与和厚朴酚牙膏的HPLC图谱如图1所示。

表4 不同料液比对厚朴酚与和厚朴酚提取的比较

2.6 超声时间的筛选

称取1g(精确至0.0001g)牙膏样品于20mL玻璃取样瓶中，加玻璃珠数颗，用移液管分别加入10mL 50%、70%、90%、100%浓度的甲醇，在转速1800r/min条件下常温振荡提取15min，超声30min，冷却至室温后提取液过0.22μm有机相滤膜，滤液上机检测，结果如表2所示。当用50%甲醇提取时，提取液难以过膜，100%甲醇提取时牙膏易板结，难以分散。以90%的甲醇提取时，牙膏更易分散，过膜时透过性相对较好，且提取率与100%甲醇相当。杨培等[5]研究发现，当甲醇浓度在10%～90%时，厚朴酚与和厚朴酚的提取率随甲醇浓度的增加而增加，而90%与100%甲醇提取结果无显著差异，与本研究结果一致。因此，综合考虑，选择90%甲醇作为提取厚朴酚与和厚朴酚的最佳浓度。

从像控点的布设方案可以看出，方案一与方案二的区别在于，方案一在测区周边未进行像控点加密，方案二在测区周边做了像控点加密，两种方案在测区内的布设方法是相同的。在测区周边均进行加密布点的情况下，设计了方案三、方案四，这两种方案与方案二的区别在于，在方案二的基础上，两个方案在测区内，旁向方向的像控点间隔航线数在增加。

表5 超声时间对厚朴酚与和厚朴酚提取的影响

2.7 确定的提取条件

称取牙膏1g(精确至0.0001g)于20mL玻璃样品瓶中，加玻璃珠数枚，再以移液管加10mL 90%甲醇，以多联漩涡混匀器于1800r/min转速下振荡提取15min，然后超声30min，冷却至室温后提取液用0.22μm有机相膜过滤，滤液待测。

2.8 优选前处理条件的精密度考察

取同一批牙膏样品6份，按照优选前处理条件处理后进行色谱分析，记录厚朴酚与和厚朴酚的含量，并计算其RSD值，结果如表6所示。由表6可知，优选的前处理条件方法精密度高，检测结果稳定。

表6方法精密度试验

3 结论

本研究考察了采用高效液相色谱法测定牙膏中厚朴酚与和厚朴酚含量时，前处理过程中提取溶剂、甲醇浓度、料液比、振荡提取时间和超声时间等5个因素对提取结果的影响。根据单因素试验的结果优选出高效液相色谱法测定牙膏中厚朴酚与和厚朴酚含量的最优前处理条件为：称取牙膏1g，加玻璃珠数枚，再以移液管加10mL 90%甲醇，以多联漩涡混匀器于转速1800r/min条件下振荡提取15min，超声处理30min。方法精密度试验结果表明，筛选出的最优前处理条件方法精密度高，有利于提高检测结果的准确性。