BioFirst实时双温微生物快速检测系统在口腔护理产品原料和化妆品原料中微生物快速检验的研究

章金宇 贾绍强 郭 莉 刘 燕 琚童霞 余思宜 杨苏成

(云南白药集团股份有限公司 中国 云南 昆明 650200)

BioFirst实时微生物双温快速检测系统是一款使用制备好的即用型检测管和基于Windows的分析软件控制的快速检测微生物代谢活动的可控温光学检测系统。其原理是基于传统的微生物培养理论、最新的二氧化碳传感技术及染色技术、新光源和光传感器来完成对微生物的检测。目标微生物在检测管中培养基的生长和测定可通过感光试剂进行检测(色彩和荧光染色)。当代谢过程发生时，该试剂的光谱模式发生改变，光传感器检测到这些变化，以预先设定好的时间间隔进行监控[1]。

对口腔护理产品原料和化妆品原料进行微生物检验，可以防止使用被微生物污染的原料进行生产，有效避免造成更大的损失，确保产品的微生物质量符合国家、市场以及公司内控标准的要求。随着新技术新方法的不断发展，出现了较多新型、先进、简便的微生物快速检测技术，可以明显缩短微生物检测的时间[2～4]。口腔护理产品原料和化妆品原料面临用量大，周转要求快，时间紧的局面，引入准确、快速的检测手段, 在保证检验结果准确可靠的前提下，有效缩短口腔护理产品原料和化妆品原料微生物检验时间，满足快速精准放行需求，提高原料使用周转效率，有效减少仓储使用面积，提高资金的使用效率。本实验针对五种不同类型的口腔护理产品原料和化妆品原料，采用BioFirst实时双温微生物快速检测系统与《2015版化妆品安全技术规范》[5]对原料中的菌落总数、霉菌和酵母菌数、耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌进行平行实验，并对其有效性进行评估。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

BioFirst实时微生物双温快速检测系统(图1)，菌落总数检测管，霉菌和酵母菌数检测管，耐热大肠菌群检测管，铜绿假单胞菌检测管，铜绿假单胞菌添加剂，金黄色葡萄球菌检测管，金黄色葡萄球菌添加剂，均为上海美凯纯生物科技有限公司；培养基(广东环凯微生物科技有限公司)，电子天平，高压蒸汽灭菌器，冰箱，生化培养箱，生物安全柜，定量菌种，涡旋振荡器，移液器等。

图1 BioFirst实时双温微生物快速检测系统

1.2 实验样品

二氧化硅、维生素E乙酸酯、山梨醇、月桂醇聚醚硫酸铵(AESA)、蛇床子提取物。

1.3 菌种选择

铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希氏菌[CMCC(B)44102)、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(ATCC16404)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)，均为广东环凯微生物科技有限公司定量菌种。

2 实验方法和结果

2.1 菌悬液的制备

2.1.1 菌落总数菌悬液制备：按照定量菌株说明书制备大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌混合液浓度约10-102CFU/mL和102-103CFU/mL的菌悬液。

2.1.2 霉菌和酵母菌菌悬液制备：按照定量菌株说明书制备黑曲霉和白色念珠菌混合液浓度约为10-102CFU/mL和102-103CFU/mL的菌悬液。

2.1.3 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌菌悬液制备：按照定量菌株说明书分别制备铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌浓度约1-10CFU/mL的菌悬液。

2.2 样品稀释液的制备

2.2.1 二氧化硅、山梨醇、月桂醇聚醚硫酸铵(AESA)、蛇床子提取物：称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的样品瓶中,充分振荡混匀，静置15min。用其上清液作为1∶10的稀释液。

2.2.2 维生素E乙酸酯：称取样品10g，加入70g灭菌生理盐水, 再分别加入10ml灭菌液体石蜡和10ml灭菌吐温80，置匀浆杯中,10000-20000转匀浆1-3分钟使成1∶10的稀释液。

2.3 菌落总数、霉菌和酵母菌数实验方法

2.3.1 BioFirst限定值检测法介绍：BioFirst实时微生物双温快速检测系统能够检测检测管中一个活的细菌或者霉菌酵母菌。基于此原理，将样品按产品放行的限量选择合适的稀释度稀释后接种到BioFirst检测管中，根据检测管的阳性变化来判断原始样品是否合格的检测方法称为限定值检测法。限量值法结果判读：如果按照限量稀释，在机器运行过程出现DT(检测时间)，则表明样品中的菌含量大于限定值；仪器未检出(无DT)，则表明样品中菌含量小于限定值。

2.3.2 取1∶10的稀释液(2.2制备)按样品限量值(企业内控标准)做进一步稀释；

2.3.3 菌落总数、霉菌和酵母菌数加菌及检测：将样品稀释液分装到空试管中，每个试管中分装9mL样品稀释液，再分别加入1mL10～102CFU/mL和102～103CFU/mL的菌落总数菌悬液、霉菌和酵母菌菌悬液(2.1中制备)，使样品稀释液菌的最终浓度为1～10CFU/mL和10～100CFU/mL；再从10～102CFU/mL和102～103CFU/mL的菌悬液中取1mL加入到9ml生理盐水管中制成浓度为1～10CFU/mL和10～100CFU/mL的纯菌液；将未加菌样品稀释液、加菌样品稀释液和纯菌液分别混合均匀后，分别取1mL加入菌落总数检测管、霉菌和酵母菌数检测管内，菌落总数检测管37℃上机检测，霉菌和酵母菌数检测管28℃上机检测；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法同步进行检测，以9mL的灭菌生理盐水为阴性对照。实验结果见图1、图2及表1。

图2 维生素E乙酸酯霉菌和酵母菌快速检验检测数据及曲线

图3 AESA菌落总数快速检验检测数据及曲线

表1 菌落总数、霉菌和酵母菌数实验结果，截取部分快速检验检测数据及曲线

2.4 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、耐热大肠菌群实验方法

2.4.1 BioFirst有和无定性检测法：对于要求包括致病菌在内的一些微生物不得检出的样品，需要进行定性检测。即先将样品在适合的培养基中进行前増菌，然后将增菌液样品接种到特异性的BioFirst检测管中，根据检测管的阴阳性变化来判断样品中是否存在有目标微生物。结果报告：机器运行过程中，如果出现DT检测时间，则进行阳性确认；仪器未检出(无DT)，则报告为阴性。

2.4.2 耐热大肠菌群加菌及检测：分别取1∶10的稀释液(2.2制备)10mL加至两瓶90mL的乳糖胆盐增菌培养基，其中一瓶加入浓度为1～10CFU/mL的耐热大肠菌群菌悬液1mL，两瓶于44.5℃下增菌18～24h。混合均匀后每瓶取1mL分别加入到耐热大肠菌群检测管内，45℃上机检测；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法同步进行检测，以10mL的灭菌生理盐水为阴性对照，实验结果见表2。

2.4.3 铜绿假单胞菌加菌及检测：分别取1∶10的稀释液(2.2制备)10mL加至两瓶90mL的SCDLP液体培养基中，其中一瓶加入浓度为1～10CFU/mL的铜绿假单胞菌悬液1mL，两瓶于37℃培养箱中培养18～24h。混合均匀后取每瓶増菌后的样液0.1mL分别加入到铜绿假单胞菌检测管，另加0.1mL铜绿假单胞菌添加剂，混匀后上机37℃检测；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法同步进行检测，以10mL的灭菌生理盐水为阴性对照，实验结果见图4、图5及表2。

图4 维生素E乙酸酯铜绿假单胞菌快速检验检测数据及曲线

图5 AESA耐热大肠菌群快速检验检测数据及曲线

2.4.4 金黄色葡萄球菌加菌及检测：分别取1∶10的稀释液(2.2制备)10mL加至90mL的SCDLP液体培养基中，其中一瓶加入浓度为1～10CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬液1mL，两瓶于37℃培养箱中培养18～24h。混合均匀后取每瓶増菌后的样液0.5mL分别加入到金黄色葡萄球菌检测管，另加0.2mL金黄色葡萄球菌添加剂，混匀后上机37℃检测；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法同步进行检测，以10mL的灭菌生理盐水为阴性对照，实验结果见表2。

表2 耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌实验结果，截取部分快速检验检测数据及曲线

3 结论

从BioFirst实时微生物双温快速检测系统检测结果和2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法的检测结果得出，5种口腔护理产品原料和化妆品原料中的菌落总数、霉菌酵母菌、耐热大肠菌群、金葡菌和铜绿假单胞菌含量均符合微生物标准。在加菌样品中，快速检测系统对菌落总数和霉菌酵母菌的个位数的菌均能检出，菌落总数中对个位数菌的检出时间在12个小时左右，对十位数菌的检出时间在10小时左右，对低至1个的霉菌酵母菌能够在40小时左右检出，对十位数的霉菌酵母菌的检出时间约为25小时。对加到样品中极少的(每g样品中添加0～10个菌)耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均能够检出，增菌后的样品能够在3小时内快速检出，在10小时内完全确定阴性结果。

2015版《化妆品安全技术规范》对微生物的检测方法中，对菌落总数的检测需要2天，霉菌和酵母菌数的检测需要5天，耐热大肠菌群和铜绿假单胞菌的检测需要2～3天，金黄色葡萄球菌的检测需要约3～5天。BioFirst实时微生物双温快速检测系统能够在18小时内完全确定样品中菌落总数的阴性结果，在48小时内确定霉菌酵母菌的阴性结果，在30小时内确定耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的阴性结果，与2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法相比大大减少检测时间。实验证明，BioFirst实时微生物双温快速检测系统检测准确、快速、与2015版《化妆品安全技术规范》结果基本一致。对于化妆品原料中菌落总数、霉菌和酵母菌数、耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检测项目的适用性良好，能够作为口腔护理产品原料和化妆品原料快速检测和放行的可靠方法，有利于口腔护理产品原料和化妆品原料在获得准确检测结果下的快速放行和质量管理人员的科学决策。

2015版《化妆品安全技术规范》方法与BioFirst实时微生物双温快速检测系统方法确定阴性检验时间对比如图6。

图6

因为口腔护理产品原料和化妆品原料很多，每个原料的性质和微生物的限量都不一样，对微生物的影响也都有不同。而现在的实验过程中，因为检测项目和检测内容过多，所以后续还需要继续进行实验，从而将各种原料的限定菌量和检测时间对应起来，从而确定各原料具体的阴性确定时间，有利于原料的精准放行，快速使用。

参考文献(略)