吉林地区汉族人群血小板表面抗原基因多态性分析

韩 瑜，杨 帆，刘玲玲，于江虹，门小菲，张晶莹，焦立新*,邱 梅

(1.长春市中心血站输血研究所，吉林 长春130033；2.吉林省疾病预防控制中心，吉林 长春130062)

血小板输注主要应用于预防和治疗血小板减少或血小板功能缺陷引起的出血，是目前临床上采取的一项重要支持疗法。但是，多次反复输入血小板的患者约有30%-70%会发生血小板输注无效(PTR)[1]。引起血小板输注无效的原因十分复杂，概括起来可归纳为非免疫因素和免疫因素[2]。而由免疫因素介导的PTR，则主要是由血小板表面的抗原引起的同种免疫反应，主要包括HLA抗原和HPA抗原[3]。国外报道也指出，引起 PTR 的抗体中HLA 抗体占 80%-90%，HPA 抗体占 5%-10%，而 HLA/HPA 复合抗体也占到了 10%-15%[4]。因此，建立本地区血小板捐献者HPA基因和HLA基因(HLA-A、B、C)资料库对于提高临床输血的安全性和有效性，具有积极的意义。笔者在前期的工作中，观察到血小板供者和患者HLA-C不合引起PTR的发生[5]。本研究对吉林地区780名汉族血小板自愿捐献者的HPA1-6，HPA-15系统的等位基因和HLA-A、B基因，和HLA-C进行基因分型，计算分析等位基因和基因型频率。同时还将HLA-C基因纳入到本研究，为血小板供者库的建立和血小板配型输注提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器DNA提取试剂盒(批号：20081410T146，西安天隆公司)；HPA-1-6，15基因分型试剂盒(批号：K202012002，天津秀鹏生物科技术开发有限公司)；人类白细胞抗原-DNA分型试剂盒(批号：A017、B021、C014，美国one lambda公司)；核酸自动化提取系统(EZBead system-32，美国TBG)；PCR仪(ABI 7500，美国ABI公司)；多功能流式点阵仪(Luminex200，美国 one lambda公司)；凝胶成像分析系统(JY04S-3C，北京君意东方)；超微量微孔板分光光度计(Epoch，美国Bio-Tek公司)。

1.2 研究对象来自吉林地区血小板无偿捐献者780人，无血缘关系，汉族，为固定无偿献血者，年龄18-45岁。征得捐献者同意后，留取EDTA 抗凝全血1.5 ml，保存-80℃冰箱备用。

1.3 DNA提取采用全血基因组核酸提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书，使用核酸自动化提取系统提取基因组DNA。DNA 浓度20-100 ng/μl，A260/A280为1.7-2.0。

1.4 基因分型HLA-A、B、C位点基因分型，采用PCR-SSOP方法，按照人类白细胞抗原-DNA分型试剂盒说明书操作，HLA Fusion软件判读结果。HPA基因分型，采用PCR-SSP方法，按照天津秀鹏公司的HPA 基因分型试剂盒说明书操作，凝胶成像分析系统拍照记录结果。HLA-C 根据α1 螺旋77 和80 位氨基酸残基的不同分为两组:Cl 组，包括HLA-C01、03、07、08、12、14、16；C2 组，包括HLA-C02、04、05、06、15、1602、17、18[6]。

1.5 统计学分析采用SPSS 18.0进行统计学分析。根据群体遗传Hardy-Weinberg(H-W)平衡，计算等位基因频率和表型频率，用χ2检验比较基因型分布观察值与期望值，验证是否符合H-W平衡。等位基因频率计算公式如下：F(a)=(2×纯合子数+杂合子数)/(2×总的个体数)，F(b)=1-F(a)。各系统对偶抗原不配合概率用以下公式计算MMP= 2ab(1-ab)，a、b 为对偶抗原等位基因频率。

2 结果

2.1 吉林地区汉族人群HLA-A、B 和C基因频率

HLA-A、B和C位点分别检出16、29 和12个等位基因。其中3个位点等位基因分布频率最高的分别是A* 02(0.1607)、B* 15(0.0822) 和C* 03(0.1255)，最高的组合为:HLA-A* 02-B* 15-C*03(0.0782) (表1)。HLA-C1C1的组合频率分布最高为0.5397，HLA-C2C2的组合分布频率最低为0.0885，HLA-C1的出现频率为0.7256，而HLA-C2的出现频率为0.2744(表2)。基因频率符合Hardy-Weinberg 平衡。

表1 吉林地区汉族人群HLA-A、B 和C基因频率

表2 吉林地区汉族人群HLA-C1和C2出现频率

2.2 吉林汉族HPA 基因型和等位基因频率分布

吉林汉族HPA基因型以aa 基因型居多，bb基因型最少，aa基因型的频率远远高于bb基因型。其中HPA-3和HPA-15检测出aa、ab和bb基因型，HPA-3aa(0.4077)，HPA-3ab(0.4154)，HPA-3bb(0.1769)，HPA-15aa(0.4872)，HPA-15ab(0.3051) ，HPA-15bb (0.2077)。HPA-3 和HPA-15的MMP最高，分别为0.3613和0.3547。因此，HPA-3 和HPA-15 系统的基因型杂合度及对偶抗原不配合率也最高(表3)。基因频率符合Hardy-Weinberg 平衡。

表3 吉林汉族HPA 基因型和等位基因频率

2.3 吉林汉族人群常见的HPA 组合与山东人群的比较

将吉林汉族人群和山东人群中HPA 基因型组合频率高于0.01的组合进行比较。吉林汉族人群HPA-1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-15aa基因型组合频率最高，为0.1731显著高于山东人群的0.1102，而山东汉族人群HPA-1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-15ab基因型组合频率最高，为0.2048显著高于吉林人群的0.0949，比较有统计学意义。两个人群HPA-1aa-2aa-3aa-4aa-5aa-6aa-15aa，HPA-1aa-2aa-3aa-4aa-5aa-6aa-15ab，HPA-1aa-2aa-3bb-4aa-5aa-6aa-15aa基因型组合频率比较，均有统计学意义。其余HPA组合型比较无统计学意义(表4)。

表4 吉林汉族人群常见的HPA 基因型组合与山东人群的比较

2.4 吉林汉族人群HPA 基因频率与其他人群的比较

吉林汉族人群HPA 基因与山东汉族在HPA-15系统比较有显著差异；与德国高加索人比较，在HPA-1、5、15这3个系统存在显著差异；与拉萨藏族比较，在HPA-1、2、5、6这4个系统有显著差异；与广东汉族人和南非黑人比较，在HPA-1、2、3、5、15这5个系统存在差异(表5)。

表5 吉林汉族人群HPA 基因频率与其他人群的比较

3 讨论

HPA 抗原目前已发现6 个抗原遗传系统共12 个抗原为双等位基因表达，分别是HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和HPA-15 抗原系统，而其余抗原发现了各自的同种异体抗体，尚未发现各自对应的抗原[12]。HLA抗原和HPA 抗原均具有较高的多态性，不同种族、地域人群的双等位基因频率有显著差异。分析本地区HPA 和HLA 基因多态性的分布特点，建立区域性血小板供者库，对有效解决因血小板同种免疫引起的PTR具有重要意义。

本研究对吉林地区780 名汉族无偿捐献血小板供者进行了HPA-1-6，15 和HLA-I 类抗原中的A、B和HLA-C位点的基因分型。HLA-A、B 和C位点分别检测出16、29 和12个等位基因，在吉林地区汉族人群中表现出较高的多态性。笔者在前期工作中发现自然杀伤细胞受体(KIR)的配体HLA-C不合引起PTR发生的病历，5名携带C2C2基因型的血小板供者与白血病患者进行血小板交叉配型，即使结果为阴性，仍然发生了PTR，因此本研究依据HLA-C的α1螺旋77 和80 位氨基酸残基的不同，将HLA-C分为Cl 和 C2两组并对其进行了分析。在780名血小板供者中以C1组为主，出现频率为0.7256，而HLA-C2的出现频率只为0.2744，携带有C1C1基因型的血小板供者占到了一半以上，而携带有C2C2基因型的供者也占到8%之多。在2002年，国外学者Saito等[13]也报道了HLA-A、B基因相合，HLA-C基因不合引起的血小板输注无效的病历。这说明HLA-C基因的配型不合，也影响了血小板输注的效果，而本研究显示在献血者中，有8%的血小板供者携带有C2C2基因型，而这部分供者的血小板输注给患者，可能会引发PTR。因此，今后患者输注血小板时应避免输注携带C2C2基因型血小板，可减少PTR的发生。

吉林汉族人群HPA-1-6，15系统中，从表3可见，HPA-3、-15系统有较高的对偶抗原不配合率，易在血小板随机输注时引起同种免疫反应，从而引发一系列的临床症状，是临床输血需要重点关注的系统。从表4 可见，吉林汉族人群常见的HPA 基因型组合与山东人群的比较，吉林汉族人群HPA-1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-15aa基因型组合频率最高，而山东汉族人群HPA-1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-15ab基因型组合频率最高，两者差别在HPA-15系统。从表5可以看出，吉林汉族人群HPA 基因频率在HPA-15系统与山东汉族比较有显著差异，与德国高加索人[比较，在HPA-1、5、15这3个系统存在显著差异，与拉萨藏族比较，在HPA-1、2、5、6这4个系统有显著差异，而与广东汉族人和南非黑人比较，在HPA-1、2、3、5、15这5个系统存在差异。这说明，吉林汉族HPA基因频率与山东地区汉族人群及其相似，这可能与人口迁徙有关，吉林地区的大部分人都是当初闯关东的后代，所以两个地区的HPA的基因频率较接近。吉林地区的汉族人群HPA基因频率与南方汉族和西部藏族的差别则是源于地域和民族的不同，而与南非黑人和德国白种人的不同则是源于人种的不同。

建立已知HLA 和HPA抗原分型的血小板志愿者资料库是解决免疫性血小板抗体导致PTR 最有效的方法。近年来，国内多地均建立了血小板供者库，但是只对供者进行HLA-A，-B 基因分型，缺少HLA-C的基因分型。本研究通过对吉林地区汉族血小板捐献者HPA的抗原基因分型和HLA-A、B 位点，特别是HLA-C位点的基因分型的检测，获得了吉林地区HPA 和HLA 基因多态性特点，并建立血小板捐献者资料库。应用到临床输血工作中进行供患者的HPA 和HLA 抗原配合性输注，可有效避免由HPA 和HLA 引起的同种免疫的发生，减少血液资源的浪费。