GPC3联合AFP、CEA、CA199检测对肝细胞癌的临床诊断价值

孙忠怡，孟凡东，隋承光，李 妍，张 巍

(1.北部战区总医院，肝胆外科，辽宁 沈阳110015；2.中国医科大学附属第一医院，生物治疗研究室，辽宁 沈阳110001)

肝癌是全球第七大高发病率恶性肿瘤，发病率逐年增加[1]。原发性肝癌主要包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和HCC-ICC混合型3种不同病理学类型，其中HCC是最主要、最常见的原发性肝癌，它们在发病机制、组织学形态、生物学行为以及预后等方面差异较大[2]。

肝组织穿刺活检作为HCC诊断的“金标准”，因其是有创检测方式，临床上不适宜反复操作，同时可能会引起患者不适，或是造成肝脏出血等风险，具有一定的局限性，而超声等影像学检查虽然无创，但不能作为确诊的标准[3]。肿瘤标志物是肿瘤细胞直接产生或是由非肿瘤细胞在肿瘤细胞的诱导下合成的一种物质，可释放入血。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是HCC诊断中常用的肿瘤标志物之一，但AFP敏感性差，采用单一肿瘤标志物检测容易造成漏诊[4]。寻找有效的诊断方式，对于肝癌早期发现、诊断和及早的干预，避免疾病进一步发展有重要意义，将有效提高患者生存质量。

作为肿瘤细胞特异性表达的代表性分子，肝细胞癌中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)表达备受关注[5]。到目前为止，针对GPC3的磁共振成像、正电子发射断层扫描和近红外成像已被用于肝癌的早期检测，研发了各种针对GPC3的免疫治疗方案，包括使用人源化的抗GPC3抗体治疗、多肽疫苗治疗、CAR-T等的治疗。用于HCC的诊断具有一定的价值，基于此，本实验同时检测GPC3、AFP、CEA及CA199在HCC患者血清中的表达水平，探讨联合检测对HCC诊断的应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月至2020年12月北部战区总医院肝胆外科和中国医科大学附属第一医院肿瘤科HCC患者75例作为患者组，其中男55例，女20例。70例良性肝脏疾病患者作为疾病对照组，包括肝脏血管瘤、肝囊肿等疾病，其中男53例，女17例。筛选70例健康志愿者作为健康对照组，其中男40例，女30例。

纳入标准：经病理及影像学诊断确诊的患者；符合《原发性肝癌诊疗规范2017年版》诊断标准；年龄大于18岁；健康对照组人群均为经过血液及超声等相关检查符合健康人群标准。排除标准：患有心理及精神疾病的患者；患有免疫系统疾病者；合并其他肿瘤患者；其他肿瘤转移性肝癌患者；接受过放化疗的患者；妊娠及哺乳期女性。

1.2 临床数据及标本采集方法

利用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)获得GPC3在肝细胞癌(LIHC-liver hepatocellular carcinoma)患者中的表达数据。所有实验者均采集清晨空腹静脉血5 ml，室温静置15 min后离心，3 000 r/min，分离上层血清。-80℃保存，以备用。

1.3 检测方法

免疫化学发光法检测血清中AFP、CEA及CA199的水平(罗氏全自动分析仪)；ELISA法检测血清中GPC3的水平，酶标仪检测其发光度。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。正常参考值：AFP<5.8 ng/ml；CEA<4.7 ng/ml；CA1199<27 U/ml。

1.4 统计学方法

本实验中数据采用SPSS22.0软件进行分析处理，计量资料均以均数±标准差方式表示。组间比较采用单因素方差分析进行，两组间的差异比较应该t检验进行分析。计算单独诊断及联合诊断的敏感度和特异度：敏感度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%；特异度=真阴性/(真阴性+假阳性) ×100%；准确度=(真阳性+真阴性)/(真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)×100%。P<0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GPC3在HCC患者中的表达及生存分析

GPC3在肝细胞癌中的表达水平明显高于正常对照组(P<0.05)，且Grade3和Grade4中GPC3的表达水平也高于Grade1和Grade2(P<0.05)，高表达GPC3的肝癌患者其生存率低于低表达GPC3的患者，但差异无统计学意义(P=0.42)(如图1、2、3)。

图1 TCGA数据库中获得的肝癌中GPC3的表达水平

图2 肝癌不同发展阶段GPC3的表达水平

图3 GPC3高表达组与低表达组生存率的比较

2.2 各组血清中GPC3、AFP、CEA及CA199的表达情况

患者血清中GPC3、AFP、CEA及CA199的表达水平，HCC患者组和疾病对照组均高于健康对照组(P<0.05)，且HCC患者组高于疾病对照组(P<0.05)，差异均具有统计学意义(如表1、图4)。

表1 血清中GPC3、AFP、CEA及CA199的表达水平(ng/ml)

图4 血清中GPC3、AFP、CEA及CA199的表达水平

2.3 血清GPC3、AFP、CEA、CA199单项检测及联合检测对HCC诊断的价值分析

血清GPC3、AFP、CEA及CA199联合检测的灵敏度、特异度及准确度分别为90.67%、89.29%和89.77%，均高于各项指标的单项检测(如表2)。

表2 血清GPC3、AFP、CEA、CA199单项检测及联合检测对HCC的诊断价值n(%)

3 讨论

肝癌进展速度很快，当出现临床症状时往往已经发展到晚期，因此，及早确诊并采取有效的治疗手段是控制病情发展、降低患者死亡率的有效措施。肿瘤标志物作为临床检测的一种方式，对于肿瘤的诊断具有一定的作用。胃癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤中均存在AFP的异常表达，当肝细胞发生炎症时也会升高。但有文献报道，27%的良性肝病患者血清中AFP的水平也会呈现升高[6]。约有30%的肝癌患者血清中AFP水平升高不明显，甚至不升高[7]。单独检测AFP，容易出现假阳性结果，灵敏度不高，易造成漏诊，影响病情变化。CEA作为一种肿瘤标志物，在多种恶性肿瘤中均有升高，正常人群中也有可能存在生理性轻度升高的情况[8]。CA199是一种糖类抗原，肝硬化及消化道肿瘤患者会有明显升高。

本实验结果显示，HCC患者组和疾病对照组患者血清中GPC3、AFP、CEA及CA199的表达水平，均高于健康对照组，且HCC患者组也高于疾病对照组。大量的研究证实GPC3蛋白在肝癌组织中高表达,而在非癌组织中没有表达或表达量极低,说明GPC3和肝癌有特定的关系。本实验通过数据库验证GPC3在肝细胞癌中的表达水平明显高于正常对照组，且Grade3和Grade4中GPC3的表达水平也高于Grade1和Grade2，高表达GPC3的肝癌患者其生存率低于低表达GPC3的患者。由于GPC3在肝癌组织及血清中特异性高表达，可作为HCC有潜能的生物标志物、治疗靶点、预后因子。

为了验证GPC3在HCC诊断中的作用，本实验又分析了血清GPC3、AFP、CEA及CA199联合检测的灵敏度、特异度及准确度，结果显示其检测数值均高于各项指标的单项检测结果。因此，GPC3将可能被确认为HCC的生物标志物，或用于评估针对GPC3的癌症免疫治疗的疗效[9]。GPC3可应用于早期肝细胞癌的病理学辅助诊断方法[10]。目前除了甲胎蛋白(AFP)，由于慢性肝病和炎症的共存抵消了其他肿瘤生物标志物的准确性，新的生物标记物还没有进入日常实践[11]。GPC3联合临床应用的肝癌肿瘤标志物，理论上可以提高肝癌的检出效率。

综上所述，GPC3作为最有前途的肝细胞癌生物标记物的不断深入研究，将为HCC的临床早期诊断和治疗提供希望。