动脉源性栓子与心源性栓子的比较转录组学研究

徐 娜,王则托,谢广成,李妙端,汤 婷,余珍珍,黄妍妍,陈文伙

(1.厦门医学院附属第二医院 神经内科，福建 厦门361021；2.承德医学院基础医学研究所；3.福建医科大学附属漳州市医院神内脑血管病介入科)

脑卒中(stroke)具有 “五高”(高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率和高疾病经济负担)特点，严重威胁人类的生命健康。我国在2005年-2019年(15年间)，脑卒中的发病率患病率呈现持续增长且发病率、患病率和死亡率等均高于发达国家同期水平[1]。因此，我国的脑卒中的防治形势仍然是任重道远[2-3]，构建中国卒中中心网络体系建设也迫在眉睫[4]。脑卒中事件中约80%左右的为急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)[5]。引起脑栓塞发生的栓子主要有供血动脉来源的栓子(动脉源性栓子)和心脏来源的栓子(心源性栓子)[6]。虽然不同来源栓子的性状已经明确，但其分子水平上的基因组成仍是未知。为此本研究利用转录组学检测动脉源性栓子和心源性栓子的转录组，旨在探讨不同来源的栓子所携带的基因差异并为确定潜在的诊断性生物标志物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料选取2021年1月至2021年5月于厦门医学院附属第二医院进行治疗的AIS患者共计26例，AIS患者经影像学(脑部CT和磁共振成像)检测确诊并符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南标准[7]。根据患者栓子来源的不同将患者分成动脉源性栓子组(12例)和心源性栓子组(14例)，患者平均年龄为(66.46±15.46)岁，最大年龄为92岁，最小年龄为30岁。患者或患者直系家属均了解研究内容并同意在取栓手术完成后将取出栓子用于本文研究，同时本研究获得厦门医学院附属第二医院伦理委员会审查批准(伦理审查批件号：2021017)。

1.3 测序数据处理原始测序数据经质控后，去除5’和3’接头序列并过滤掉≤20 bp的过短片段，得到调整后数据(trimmed data)并进行数据比对，比对结果良好的数据进行基因和转录本表达定量分析、差异表达基因筛选、Gene Ontology (GO) (http://www.geneontology.org/) 进行生物学过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (https://www.kegg.jp/)进行通路分析。使用CPAT预测新转录本的编码能力，rMATS完成组间Alternative 5’ splice site(A5SS)、Alternative 3’ splice site(A3SS)、Skipped exon(SE)、Retained intron(RI)和Mutually exclusive exons(MXE)差异可变剪切事件的分析。

1.4 数据统计分析采用Ballgown定量动脉源性栓子组和心源性栓子组样本表达水平及组间的基因和转录本的表达差异，设定变化倍数≥1.5倍，P≤0.05且组内FPKM均值≥0.5界定为差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)和差异表达转录本(differentially expressed transcripts,DETs)。

2 结果

2.1 两组栓子转录组检测比较热图分析显示动脉源性栓子组和心源性栓子组的基因表达谱具有明显的差异(图1A)。动脉源性栓子共鉴定出11080个基因和24759个转录本，心源性栓子共鉴定出10658个基因和24166个转录本；动脉源性栓子与心源性栓子相比，共有762个上调的DEGs，前5位上调DEGs分别为CYR61、ECSCR、EREG、CCL20、CTGF；共有508个下调DEGs，前5位下调DEGs分别为PLAU、FAM27B、TGM3、ST20-MTHFS、AMDHD2(图1B)。共有1661个上调的DETs，前5位上调DETs分别为MAX-210、ACTN1-204、HIF1A-212、EEF1A1-204、CTNNB1-209；共有1191个下调的DETs，前5位下调DETs分别为ATG2A-202、TBC1D2-203、P4HB-203、SIPA1L1-203、STAT5A-209。上调和下调的DEGs分别定位在不同的染色体上(图1C),见图1。

图1 动脉源性栓子与心源性栓子的转录组检测

2.2 两组栓子DEGs的GO分析BP分析显示，下调DEGs主要富集在regulation of cellular process、response to stimulus、immune response(图2A)，上调DEGs主要富集在regulation of cellular process、response to stimulus、regulation of primary metabolic process(图2D)；CC分析显示，下调DEGs主要富集在cytoplasm、cytosol、membrane(图2B)，上调DEGs主要富集在cytoplasm、membrane-bounded organelle、intracellular membrane-bounded organelle(图2E)；MF分析显示，下调DEGs主要富集在protein binding、catalytic activity、metal ion binding(图2C)，上调DEGs主要富集在protein binding、protein-containing complex binding、cell adhesion molecule binding(图2F)，见图2。

图2 动脉源性栓子与心源性栓子的DEGs的GO分析

2.3 两组栓子DEGs的KEGG分析两组下调DEGs的KEGG通路富集共得到67条信号途径(P<0.05)，前3条信号途径分别为Measles、Epstein-Barr virus infection、Hepatitis_C(图3A)；两组上调DEGs的KEGG通路富集共得到35条信号途径(P<0.05)，前3条信号途径分别为Spliceosome、Protein export、Small cell lung cancer(图3B),见图3。

图3 动脉源性栓子与心源性栓子的DEGs的KEGG分析

2.4 两组栓子新转录本编码能力预测通过对两组栓子进行mRNA高通量测序，共计得到88570个新转录本，将预测的新转录本的编码能力≥0.462为阈值，共计5464个新转录本具有编码能力，其中前五位具有编码能力的新转录本ID号分别为MSTRG.86325.23、MSTRG.86325.8、MSTRG.92497.14、MSTRG.92497.6、MSTRG.92497.3，见图4。

图4 动脉源性栓子与心源性栓子中新转录本编码能力预测

2.5 两组栓子差异可变剪切事件A5SS剪切事件共计2607个，其中差异可变剪切事件共计386个(上调213个、下调173个)；A3SS剪切事件共计4026个，其中差异可变剪切事件共计561个(上调297个、下调264个)；SE剪切事件共计32610个，其中差异可变剪切事件共计3919个(上调2201个、下调1718个)；RI剪切事件共计3650个，其中差异可变剪切事件共计748个(上调322个、下调426个)；MXE剪切事件共计4159个，其中差异可变剪切事件共计934个(上调414个、下调520个)，见图5。

图5 动脉源性栓子与心源性栓子中差异可变剪切事件

3 讨论

血栓是引起脑卒中的主要栓子之一，在颅内动脉粥样硬化基础上由于血管狭窄或粥样硬化斑块破裂形成的动脉源性栓子；栓子在心脏或其他部位形成并通过血流栓塞至颅内进而形成心源性栓子。目前已基本确定纤维蛋白、血小板及红细胞是血栓的主要成分[6]。不管是哪种栓子引起的脑卒中都给患者带来严重的疾病负担、经济负担和治疗负担[8]。因此需要开展脑卒中的基础研究与临床研究的相结合，特别是应用基于高通量检测的蛋白质组学、代谢组学、基因组学和转录组学技术能够为脑卒中的潜在诊断性生物标志物确定和靶向生物治疗提供的可能。我国已经在缺血性脑卒中的基础与临床研究中取得重要研究成果[9]。基于全基因组研究表明TSPAN2与大动脉粥样硬化型卒中有关，PITX2和ZFHX3与心源性卒中有关，而ALDH2与所有缺血性卒中有关[10]。基于代谢组学研究脑卒中患者内源性代谢产物已经取得长足进展[11]，急性脑梗死患者血浆代谢组学研究表明谷氨酸、瓜氨酸/精氨酸在大动脉粥样硬化型脑梗死患者血浆中水平偏高，蛋氨酸/苯丙氨酸、丙酰基肉碱/乙酰基肉碱、己酰基肉碱在穿支动脉疾病型患者血浆中水平偏高，上述代谢物可能作为脑梗死预测的潜在生物标志物[12]。AIS患者血清中提取总脂质后进行脂质组学，结果显示共鉴定到1054个脂质特异性差异，准确定性得到368个脂质分子[13]。与正常健康人相比，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血液中外泌体mRNA、lncRNA、circRNA的数据分析显示共确定出312个差异mRNA、43个差异lncRNA和85个差异circRNA[14]。另外，基于血液来源的潜在生物标志物在缺血性脑卒中研究中也取得相应进展，S100钙结合蛋白B、胶质纤维酸性蛋白和泛素C末端水解酶-L1可作为中枢神经系统损伤相关生物标志物；基质金属蛋白酶、L-精氨酸途径代谢产物等可作为血管损伤/再生及凝血/血栓形成相关生物标志物[15]。

上述基于脑卒中患者体液(血液)确定的循环型生物标志物能够为脑卒中患者诊断提供科学依据。但是脑卒中患者血栓自身成分的确定能够为明确血栓形成和进一步确定出更为精确的潜在生物标志物提供更为准确的数据。AIS患者取栓手术中取出的血栓进行蛋白质组学检测，共计鉴定出1600种蛋白质组分，其中339个蛋白是共性表达蛋白[16]。收集心源性脑卒中和大动脉粥样硬化型脑卒中患者的血栓标本进行反向蛋白芯片检测，共鉴定到31个蛋白参与到血小板/内皮细胞功能、炎症、氧化应激和代谢组[17]，该研究得到的结果能够为血栓微环境的细胞互作提供依据，但是该研究所使用的蛋白芯片只能检测到数量局限的蛋白。本研究中同样收集心源性脑卒中和大动脉粥样硬化型脑卒中患者的血栓标本，进行基于高通量测序的转录组学研究，动脉源性栓子和心源性栓子分别鉴定出11080个和10658个基因，两种不同来源的栓子进行差异基因的确定，共计确定出762个上调的DEGs和508个下调DEGs，GO分析和KEGG信号途径分析显示，上调和下调DEGs参与到不同的生物学过程、细胞组分和分子功能，涉及到不同的信号途径。另外高通量转录组测序同时鉴定出88570个新转录本，总计5464个新转录本具有编码能力，此外还鉴定出数量不一的5种类型的A5SS、A3SS、SE、RI、MXE差异可变剪切事件。

综上所述，本研究利用高通量转录组测序技术，鉴定出动脉源性栓子和心源性栓子的基因组成、差异表达的基因和转录本，构建了差异基因的GO和KEGG通路网络，鉴定了新转录本编码能力、差异可变剪切事件类型和数量，这一结果为后期研究动脉源性栓子和心源性栓子潜在的生物标志物和血栓生成提供了科学依据。