阴道微生态改变与高危人乳头瘤病毒感染的关系研究

沈彩糯，王巧亚，洪威阳，陈志勇

有研究显示长期持续感染高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）会直接导致子宫颈癌的发生和发展[1]，而针对HPV的感染和清除机制目前尚无明确的定论。基于阴道内部环境的微生态结构改变和宫颈HR-HPV 感染均可引起阴道优势菌群的减少及阴道自净能力的下降[2]。由此，本研究观察阴道内部环境的微生态结构改变与宫颈HR-HPV持续性感染的相关性，为宫颈癌预防和治疗方面提供一种新的思考方向，也为后续宫颈HR-HPV的诊治及研究提供新的理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019 年1 月至2020 年10 月就诊于宁波市奉化区人民医院妇科门诊以及向社会招募的共计300 名妇女。根据HR-HPV DNA 检测结果分为两组，观察组为HR-HPV DNA阳性（150 例），对照组为HR-HPV DNA阴性（150 例），收集两组阴道毛滴虫病（TV）、外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）、阴道pH 值、白细胞酯酶浓度、唾液酸苷酶浓度、过氧化氢浓度、阴道清洁度及线索细胞阳性等情况。本研究项目已经获得医学伦理委员会审批。

1.2 入组及剔除标准 入组标准：（1）既往无抗HPV 治疗及疫苗接种史；（2）检查前3 d 内无性生活、未进行阴道内治疗及操作；（3）知情同意。剔除标准：（1）绝经期女性；（2）处于妊娠期及哺乳期；（3）近期接受性激素、免疫抑制剂及抗生素等药物治疗；（4）有恶性肿瘤手术及放化疗病史；（5）月经不规律或近半年内有异常阴道出血病史；（6）既往有宫颈治疗或锥切、子宫全切及次切术史；（7）患有慢性肾病、糖尿病及高血压等全身性重大疾病史，或者有自身免疫性疾病；（8）有HPV 疫苗接种史。

1.3 方法

1.3.1 标本采集方法（1）阴道分泌物采样：于月经干净1 周内，嘱研究对象排空膀胱后躺于检查床上，摆成膀胱截石位，放入阴道窥阴器，充分暴露宫颈，拿2根无菌卫生棉拭子，将阴道侧壁上1/3 处的阴道分泌物沾取后放入已标记上研究对象编号的试管中，尽快送化验室进行后续检测。（2）HPV DNA 检测采样：采用专属HPV采样刷子，在宫颈管位置上，沿着同一个方向反复旋转3～5 次后取出，将已经采样的刷子头直接浸入已标记上研究对象编号的专用保存液中，于4℃冰箱中保存，尽快行后续检测。

1.3.2 检测方法及指标（1）检测阴道清洁度：于载玻片上均匀涂抹采集到的阴道分泌物，进行相应处理后行革兰染色，高倍显微镜下根据不同菌群集落进行分组，再按照阴道清洁度标准分级，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度。（2）检测阴道病原体：将采集的阴道分泌物其中一根无菌棉拭子均匀涂抹在滴了一滴0.9%氯化钠注射液的载玻片上，于常规倍数显微镜下查找阴道毛滴虫、真菌孢子或菌丝、线索细胞等病原体。找到阴道毛滴虫即可诊断为TV；找到真菌孢子或菌丝，可诊断念珠菌性VVC；检测出线索细胞，可诊断细菌性阴道病（BV）。（3）检测阴道分泌物酶学指标：将另一根采集的阴道分泌物无菌棉拭子进行光化学酶法试验，使用快速BV 检测试剂盒对标本进行功能酶学显色观察。pH 值正常范围为3.8～4.4，pH 值＞4.5 为阳性；对应检测唾液酸苷酶的框显红色或紫色为阳性；对应检测过氧化氢的框显蓝色为阳性，显出红色或紫色为阴性；对应白细胞酯酶的框显蓝色或绿色为阳性；其中一项或多项阳性，即提示阴道炎症存在[3]。（4）HR-HPV 分型检测采用凯普PCR 导流膜杂交法，同时检测包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58 等分型。

1.4 统计方法 采用SPSS 27.0 统计软件进行分析，计数资料采用检验，多因素分析采用Logistic 回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组阴道微生态各项指标比较观察组TV、VVC、pH、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、过氧化氢、阴道清洁度及线索细胞阳性率均高于对照组（均P＜0.05），见表1。

表1 两组阴道微生态各项指标比较 例（%）

2.2 多因素分析 TV、VVC、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、过氧化氢、阴道清洁度、细索细胞、阴道pH值均是宫颈HR-HPV感染的危险因素（均P＜0.05），见表2。

表2 阴道微生态指标与宫颈HR-HPV 的多因素分析

3 讨论

宫颈癌与宫颈HR-HPV的持续感染关系密切，然而并不是所有感染了HPV的女性均会发展为宫颈癌，大部分女性感染HPV 后可在短暂或间歇感染后逐渐被清除，一般时间为8 个月至2 年。而国内外目前关于宫颈HR-HPV感染的机制还处于病因学研究的阶段。有研究提出阴道乳酸杆菌减少，以及加德纳菌或混合性厌氧菌大量繁殖，产生了许多有害的代谢产物，联合作用于宫颈，可以加速宫颈癌的发生发展[3]。由此可以联想到以乳酸杆菌减少为主要表现的各种阴道内部环境的微生态改变与宫颈HRHPV 感染后进展为宫颈浸润癌必然存在一定的相关性。已有多项研究发现BV、TV、VVC 是宫颈HR-HPV 感染的高危因素[4-5]，本研究结果与之相似。

正常的阴道内环境中共存活300 多种微生物，包括多种厌氧菌和需氧菌，其中最为重要的当属乳酸杆菌，在健康女性的阴道分泌物标本中可分离出高达50%～80%的乳杆菌。阴道内部环境中各种菌群之间互相协调，互相制约，使得阴道内微生态环境保持相对稳定。阴道内存在的这些正常菌群可以维持阴道局部环境处于一种弱酸性状态，pH值为3.8～4.5。弱酸性环境可以很好地抑制阴道内其他致病微生物病原体的生长繁殖；另外乳酸杆菌还可以通过竞争、黏附和替换等方式阻止阴道内致病微生物病原体的聚集、黏附和生长，从而在预防阴道炎症性疾病中发挥重要的阴道自净作用[6]。

BV 是以线索细胞增生为主要表现的阴道炎性疾病，其阴道内杂菌数量明显增多，乳酸杆菌数量明显下降，阴道内部菌群数量及种类失衡。乳酸杆菌的减少使得阴道内乳酸减少，阴道pH 上升，过氧化氢减少，从而阴道自净能力进一步下降，便于致病微生物病原体（包括衣原体、支原体、细菌、HPV 病毒等）进一步侵入，加重阴道局部炎症反应。TV 是感染阴道毛滴虫所致的阴道炎性疾病。阴道毛滴虫通过吞噬或消耗阴道上皮细胞内的糖原，从而阻碍正常菌群产生乳酸，导致阴道内环境pH 值上升，破坏阴道内环境的弱酸性状态，从而使得阴道内环境状态更便于其他杂菌或致病微生物的侵入和生长繁殖。另外阴道毛滴虫还能够消耗氧气，形成一种厌氧的环境，更加不利于阴道内环境中乳酸杆菌的生长繁殖，反而导致了厌氧菌的增殖。VVC主要是白色假丝酵母菌感染，正常情况下人体也可携带，为条件致病菌，在无症状寄居及传播中起作用的是酵母相，可检测出真菌孢子；而具备侵袭组织能力的为菌丝相，可检测到真菌菌丝。正常健康状态下，假丝酵母菌的生长和繁殖受到乳酸杆菌的抑制，而一旦乳酸杆菌的数量缺乏或减少，则会增加VVC的发生。VVC 的感染使得阴道内上皮组织的通透性增强、产生侵袭性酶、上皮细胞损伤、阴道防御屏障损伤和菌群失调，导致阴道内炎症的蔓延和加重，有利于其他致病微生物的侵入。而HPV 病毒是一种嗜好侵入上皮组织内的无包膜的环状双链DNA病毒，感染后可以导致宫颈及阴道的上皮细胞发生病变，从而减弱阴道的物理屏障作用，也使得局部细胞的免疫功能受到影响，进一步加重阴道内环境微生态紊乱程度[7]。本研究结果进一步证实了BV、TV、VVC与宫颈HRHPV 的感染存在密切关系。

有学者研究后提出结合阴道分泌物的常规镜检和功能酶学检测在阴道微生态早期改变的诊断中有一定的指导意义，借助功能酶学多个项目的联合分析可以更全面的了解阴道微生态情况[8]。pH值＞4.5 提示阴道内弱酸性状态遭到破坏，更利于阴道内杂菌的增生繁殖，而相应的乳杆菌数目就会减少且功能减弱，这提示阴道内环境可能处于炎症状态。白细胞酯酶是白细胞裂解释放的物质，其阳性反应表明阴道中性粒细胞存在且数量增多，即存在阴道炎症可能。唾液酸苷酶通过分解糖蛋白中的唾液酸来降解黏液，从而防止生殖道潜伏的病原体与阴道上皮细胞的直接接触，在促进鳞状上皮细胞剥脱及厌氧菌黏附在阴道表面时唾液酸苷酶均具有重要的作用，阴道黏膜物理保护屏障的受损与破坏可导致生殖道病原体感染率的增加。通过检测过氧化氢浓度可用于评价乳酸杆菌数目和功能。过氧化氢浓度升高侧面反映了乳酸菌数目和功能的下降，提示阴道内微生态处于失衡状态。阴道清洁度异常表明阴道内菌群的多样性和密集性增加，提示阴道可能存在感染。本研究结果显示观察组pH 值、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、过氧化氢、阴道清洁度及线索细胞阳性率均高于对照组（均P＜0.05），这进一步从阴道功能酶学的层面上证实了宫颈HR-HPV 感染与阴道内环境微生态结构改变具有相关性。