食品中乳酸杆菌的实时荧光PCR 的快速检测运用

齐越

通辽市食品药品检验所食品室 内蒙古通辽 028000

乳酸杆菌大量存在于各种乳制品中，常见的有保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸杆菌和乳酪乳杆菌等，这些乳酸杆菌可以被用来食品发酵和生物检定，但是一些乳酸杆菌尤其是乳杆菌也可能成为物质腐烂的主要细菌之一。在微生物种类检定中，常用高度保守性的16S rDNA 序列进行检定，本文针对含有酒花物质的啤酒，利用实时荧光PCR 技术对啤酒中的乳酸杆菌进行检测和控制，设计通用引物和特异性探针，验证该技术方法在乳酸杆菌的检定中具有高度特异性、灵敏度和快速简便的特征。

1 试验材料和试验方法

1.1 原材料

本试验选择植物乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌开展试验，所有菌种均从实验室分离得到[1]。

1.2 试验设备和试剂

本试验研究选择实时荧光PCR 基因扩增设备、台式高速离心机、恒温振荡设备和厌氧罐作为试验设备，选择MRS 等培养基，以及细菌基因组DNA 提取试剂盒等试剂。

1.3 试验方法和试验步骤

首先第一步，在培养基中进行细菌培养，然后从试剂中提取基因组DNA，要求在有氧和厌氧的条件下分别培养菌种，以37℃的温度恒温培养48 小时后提取细菌。第二步，设计实时荧光PCR通用引物和特异性探针，即针对16S rDNA 序列同源性通用比较和非同源性参考菌株的特异性检测，在同源性较高的地方设计乳酸杆菌通用性引物和探针。第三步，将乳酸杆菌菌株稀释到不同的梯度后，在不同的反应温度和时间下开展灵敏度检测。具体检测步骤包括：将乳酸杆菌标准菌株放置于相应的培养基中培养一段时间，然后检测其灵敏度值，估计菌株的数量，然后按照不同梯度进行稀释，取最后几个梯度的菌株液涂平板计数，如此循环多次后取平均值确定最后的菌密度，将每一个梯度的菌株液体各取3 管开展实时荧光PCR 检测，并将检测的结果和平板计数结果相对照，以确定反应菌株的灵敏度情况。最后第四步开展特异性检测，即将乳酸杆菌标准菌株、大肠杆菌、沙门氏菌、黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、弗氏志贺菌分别放置在菌液中培养并提取细菌DNA，将以上几种细菌的DNA 混合后再进行实时荧光PCR 检测，可检测非同源性参考菌株的特异性[2]。

2 试验结果和分析

2.1 灵敏度检测结果

将植物乳酸杆菌菌株按照一定的梯度进行稀释以后，采用实时荧光PCR 进行检测，根据平板计数可得到检测的浓度是83CFU/mL。将干酪乳杆菌按照同样的倍数和方法稀释以后，再利用实时荧光PCR 进行检测，根据平板计数的结果可得到最终检测的浓度是100CFU/ml。针对保加利亚乳酸杆菌的灵敏度检测，按照1-7的倍数进行稀释后，再利用实时荧光PCR 检测，根据平板计数结果检测得到的浓度是40CFU/ml。

2.2 特异性试验结果

从非同源性参考菌株的实时荧光PCR 特异性检测结果可知，乳酸杆菌得到了扩增，所有非乳酸杆菌没有检测到荧光信号，说明实时荧光PCR 在检测乳酸杆菌的方面具有较好的特异性[3]。

3 试验结果讨论

从上文对食品中乳酸杆菌的实时荧光PCR 检测分析可知，利用厌氧培养法和平板计数是常见的检测方法，在培养基中培养出试验所需的菌株以后，可直接肉眼观察初步分析结果。乳酸杆菌的细胞呈多样化多形态，有细长状、弯曲状和短杆状等，其一般处于静止状态，无芽孢。采用厌氧平板法检测时间较长，往往需要一周甚至更久才能观测到结果，这样就无法及时反映微生物是否具有污染特性且污染的严重性。对于乳酸杆菌而言，其在形成的过程中对营养的要求比较高，培养特性特殊，无法使用传统平板培养法进行培养，而且后期分离这些培养菌株也需要一定的时间。因此，需要采用更加快速高效且灵敏度更高的针对乳酸杆菌的培养、检测检验方法。PCR 检测法在一开始在应用时，存在假阳性污染与定量分析和准确度不高的问题，这些年来开始采用实时PCR 荧光定量检测技术，该技术方法的使用不但可以进行乳酸杆菌的定量检测还能进行定性分析，特异性和灵敏度较高，且定量检测更加准确、速度更快，定性分析也更加精准，将其用在分子生物学检定实验中具有突出的优势。

本文针对食品中的乳酸杆菌，针对16S rDNA 序列设计了扩增乳酸杆菌通用引物和非同源性菌株特异性检测试验。在采用实时荧光PCR 检测时，采用乳酸杆菌通用引物出现了特异性扩增，而非乳酸杆菌没有出现特异性扩增。这说明所采用的乳酸杆菌引物和探针都具有较高的特异性，并且只特异性扩增了乳酸杆菌。

4 结语

综上所述，随着对食品质量和食品安全的高度重视，提高食品质量检测的速度、效率和效果已经势在必行。在对食品乳酸杆菌检测方面，常规检测方法不仅效率不高而且检测结果的精确性较低，检测时间较长无法很准确反映微生物的污染情况。为此，本试验设计了采用实时荧光PCR 检测食品中乳酸杆菌的方法，提高了检测的质量可靠性和准确性，且能在较短的时间内反映污染物的特性，实用性和时效性较强，将其应用在生物分析鉴定中具有十分广阔的应用发展前景，为乳酸杆菌的试验检测技术和理论的发展奠定良好基础。