齐墩果酸对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用及机制研究

郑霞薇，黄丽丽，谢国民

缺血性脑卒中是急性脑血液循环障碍导致脑组织缺血缺氧性坏死所致的临床综合征，具有高发病率、高致残率、高病死率等特点，然而目前临床上仍缺乏有效的治疗药物[1-4]。齐墩果酸是一种五环三萜类化合物，广泛存在于各种植物中，如丁香、大蒜叶等，具有抗凋亡、抗氧化及抗肿瘤等作用[5-6]。Rong 等[7]发现齐墩果酸能改善脑缺血大鼠神经功能缺损症状，然而其潜在的机制尚不清楚。有文献报道齐墩果酸可通过激活PI3K/Akt 信号通路抑制肝细胞凋亡，减轻大鼠肝再灌注损伤[8]。因此，本研究旨在探讨齐墩果酸对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作及其调控机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 试验动物 选取健康清洁级成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠45 只，体质量250～280 g，饲养于室温21～25℃，湿度50%的环境。本实验严格遵守国家动物实验相关指导方针。

1.2 实验流程

1.2.1 分组 采用随机数字表法将SD 大鼠分为假手术组，脑缺血再灌注组，齐墩果酸组，齐墩果酸+DMSO 组，齐墩果酸+LY294002（PI3K 抑制剂）组。

1.2.2 药物干预 齐墩果酸组、齐墩果酸+DMSO组、齐墩果酸+LY294002 组大鼠于术前4 d 开始腹腔注射齐墩果酸（25 mg/kg），每天1 次；假手术组及脑缺血再灌注组腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液。齐墩果酸+LY294002 组和齐墩果酸+DMSO组大鼠分别于术前4d侧脑室注射10μl10mmol/L LY294002 溶液（LY294002加入DMSO 中配制而成）或10μl DMSO 溶液1 次。

1.2.3 侧脑室注射 大鼠麻醉后俯卧位固定于脑立体定位仪上，备皮消毒后头部正中作1 cm 切口，清楚暴露前囟点，以前囱点为坐标原点，向右旁开1.4mm，向后1mm为注射点，颅骨钻头钻取颅孔，在脑立体定位仪的引导下将微量注射器针头垂直插入4.5mm，即达侧脑室，以2μl/min的注射速度注射10μlLY294002 溶液或10μlDMSO溶液，后缓慢退出注射器，缝合皮肤。

1.2.4 模型制备 参照改良ZeaLonga线栓法制备脑缺血再灌注模型。SD 大鼠经戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后消毒颈部皮肤，作颈部正中纵行切口，仔细分离血管和神经。线栓从颈外动脉插入，经颈内动脉直至大脑中动脉起始处，实现大脑中动脉的梗阻。2 h 后重新麻醉，拔出线栓，实现再通。假手术组按上述方法分离组织及暴露神经和血管，插入线栓，但不阻断大脑中动脉的血流。

1.2.5 神经功能损伤评分 术后24 h 采用Rogers神经功能评分标准（具体评分细则见表1）对各组大鼠进行神经功能缺损评分。为了控制实验基线水平，若Rogers 评分为0、6 或7 分，以及出现蛛网膜下腔出血则不纳入后续试验。

表1 Rogers 神经功能评分标准

1.2.6 TUNEL 染色 术后24 h 对各组大鼠进行麻醉，先后予0.9%氯化钠注射液、4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液经左心室灌流，迅速断头取脑，常规石蜡包埋并切片（厚度5μm）。切片脱蜡后，使用原位细胞凋亡TUNEL 试剂盒检测凋亡细胞。正置荧光显微镜下观察（×200 倍数）脑梗死周围组织的凋亡情况，Image-ProPlus 图像分析处理系统计数凋亡细胞数，凋亡细胞率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.7 Western Blot 检测 采用Western Blot 检测Bax、Bcl-2、p-Akt、Akt 蛋白水平。术后24 h 各组大鼠经戊巴比妥钠（30 mg/kg）、0.9%氯化钠注射液左心室灌流后断头取脑，冰上分离出脑梗死周围脑组织，与裂解液按比例混合后，经匀浆、裂解、超声提取组织蛋白。BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，根据浓度制备Western Blot 上样品，分别进行SDSPAGE 电泳分离，后转至PVDF 膜上，经5%脱脂奶封闭、一抗孵育、二抗孵育后，凝胶成像仪对PVDF膜进行扫描曝光，Imag Lab 软件进行灰度分析。

1.3 统计方法 采用SPSS 20.0软件统计进行分析，使用GraphPad Prism、Photoshop 进行绘图。计量资料用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损的影响 假手术组大鼠未见神经功能缺损的症状。其他4 组大鼠术后24 h 神经功能缺损评分差异有统计学意义（F=3.605，P＜0.05），其中齐墩果酸组神经功能缺损评分低于脑缺血再灌注组（P＜0.05），齐墩果酸组与齐墩果酸+DMSO 组神经功能缺损评分差异无统计学意义（P＞0.05），齐墩果酸+LY294002 组神经功能缺损评分高于齐墩果酸组和齐墩果酸+DMSO 组（均P＜0.05）。见彩图1。

图1 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损的影响

2.2 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响 5 组大鼠术后24 h时梗死侧梗死灶周脑组织细胞凋亡率差异有统计学意义（F=22.611，P＜0.05），其中脑缺血再灌注组细胞凋亡率高于假手术组（P＜0.05），齐墩果酸组细胞凋亡率低于脑缺血再灌注组（P＜0.05），齐墩果酸组与齐墩果酸+DMSO组细胞凋亡差异无统计学意义（P＞0.05），齐墩果酸+LY294002 组细胞凋亡率均高于齐墩果酸组和齐墩果酸+DMSO 组（均P＜0.05）。见彩图2。

图2 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

2.3 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后Bax、Bcl-2 蛋白表达水平的影响 5 组大鼠术后24 h 梗死侧梗死灶周脑组织Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白表达量差异均有统计学意义（F=22.612、10.394，均P＜0.05）。其中脑缺血再灌注组Bax 蛋白表达量高于假手术组，Bcl-2 蛋白表达量低于假手术组（均P＜0.05）；齐墩果酸组Bax 蛋白表达量低于脑缺血再灌注组，Bcl-2 蛋白表达量高于脑缺血再灌注组（均P＜0.05）；齐墩果酸组与齐墩果酸+DMSO 组Bax、Bcl-2 蛋白表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05）；齐墩果酸+LY294002 组Bax 蛋白表达量高于齐墩果酸组和齐墩果酸+DMSO 组，Bcl-2 蛋白表达量低于齐墩果酸组和齐墩果酸+DMSO 组（均P＜0.05）。见彩图3。

图3 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后Bax、Bcl-2 蛋白表达水平的影响

2.4 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后p-Akt/Akt 的影响 5 组大鼠术后24 h 梗死侧梗死灶周脑组织p-Akt/Akt 差异有统计学意义（F=51.216，P＜0.05）。其中脑缺血再灌注组p-Akt/Akt 低于假手术组（P＜0.05），齐墩果酸组大鼠p-Akt/Akt 高于脑缺血再灌注组（P＜0.05），齐墩果酸组与齐墩果酸+DMSO 组p-Akt/Akt 差异无统计学意义（P＞0.05）；齐墩果酸+LY294002 组p-Akt/Akt 均低于齐墩果酸组和齐墩果酸+DMSO 组（均P＜0.05）。见彩图4。

图4 齐墩果酸对大鼠脑缺血再灌注损伤后p-Akt/Akt 的影响

3 讨论

缺血性脑卒中所造成的脑损伤与众多病理过程相关，包括谷氨酸兴奋毒性、凋亡、钙超载及活性氧生成等[9]。近年来，尽管许多药物在动物实验中表现出显著的神经保护作用，但都未能通过严格的临床随机试验验证。本研究主要目的是加深对脑梗死发病机制的了解，并促进脑梗死临床治疗药物的研发。

近年来，有文献指出齐墩果酸是缺血性脑卒中潜在的神经保护药物[10]。Rong 等[7]发现齐墩果酸能显著延长急性脑缺血小鼠生存时间，改善神经功能。Caltana 等[11]研究发现齐墩果酸在大鼠局灶性脑缺氧模型中也发挥重要的神经保护作用。然而，齐墩果酸神经保护作用机制仍有待进一步研究。大量研究发现齐墩果酸在许多动脉模型中发挥抗凋亡作用，如肝缺血再灌注损伤、急性肺损伤及脊髓损伤等[12-14]。本研究发现齐墩果酸能显著降低神经功能缺损评分，TUNEL染色结果表明齐墩果酸明显减少脑缺血再灌注大鼠凋亡细胞，Western Blot 结果表明齐墩果酸明显增加脑缺血再灌注大鼠Bcl-2 的表达、减少Bax 表达。由此可见，齐墩果酸对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用，可能与其抗细胞凋亡作用相关。

PI3K/Akt 是一种细胞生存通路，具有抗凋亡、减轻炎症的作用[15]。有文献报道齐墩果酸可通过激活PI3K/Akt 信号通路抑制肝再灌注损伤大鼠的肝细胞凋亡[8]。本研究通过Western Blot 法检测脑缺血再灌注大鼠的p-Akt、Akt 的蛋白表达，结果表明脑缺血再灌注大鼠p-Akt/Akt 显著下调，而给予齐墩果酸治疗后p-Akt/Akt 显著上调。而给予脑缺血再灌注大鼠齐墩果酸和PI3K 抑制剂LY294002 共同处理后，p-Akt/Akt显著下调，且齐墩果酸对脑缺血再灌注大鼠的抗凋亡作用受到显著的抑制。由此可见，齐墩果酸是通过调节PI3K/AKT 通路减少大鼠脑缺血/再灌注后的细胞凋亡。

综上所述，齐墩果酸是通过调节PI3K/AKT 通路减少大鼠脑缺血再灌注后的细胞凋亡，从而发挥神经保护作用。本研究结果可为脑梗死的临床治疗提供新的治疗药物，且对缓解脑梗死患者的临床症状，改善预后具有重要价值。