母乳和婴儿配方奶粉中唾液酸体外模拟消化研究

孙晨 刘丽波 李春* 刘宁 2*

1.东北农业大学 食品学院 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.黑龙江省乳品工业技术开发中心(国家乳业工程技术研究中心)，哈尔滨150028

母乳是婴儿最理想的天然食物。它含有婴幼儿生长发育所必需的各种营养成分，对婴幼儿存活、生长和发育都极为重要，且其具有最高的生物利用率[1]。母乳中含有丰富的功能性低聚糖，比如唾液酸，它是一类酸性九碳单糖，一种神经氨酸衍生物，可以促进婴儿大脑的发育并且提高学习能力[2]。唾液酸的主要来源是母乳，尤其是初乳中的含量最高，以寡聚糖、糖蛋白和糖脂形式存在[3-4]。人乳中唾液酸的含量在250-1500mg/L，而目前市售婴儿配方奶粉中唾液酸含量不及200mg/L[5]。目前，美国婴儿配方奶粉通过添加酪蛋白糖巨肽来增加唾液酸的含量，使其接近人乳中总含量[6]。虽然在总含量上接近人乳，但蛋白质结合唾液酸约占70 %，游离、低聚糖结合约占30 %，这与人乳中唾液酸存在模式(蛋白质结合唾液酸约占24 %，游离、低聚糖结合唾液酸占76 %）相差很大，可能会使婴儿配方奶粉中的唾液酸在胃肠内不能充分吸收和利用，对婴儿大脑神经系统发育产生不利影响[7-8]。实验室参照人乳中唾液酸含量和国外婴儿配方奶粉中唾液酸添加标准，研制干法添加游离唾液酸婴儿配方奶粉。通过添加游离唾液酸来降低婴儿配方奶粉中蛋白质结合唾液酸所占的比例，使其与人乳唾液酸存在模式更加接近，进而在消化吸收方面与母乳相似。通过测定，当添加量为0.14-0.28kg/t时，婴儿奶粉中唾液酸的含量可达到生产要求。虽然添加量达到生产要求，但婴儿配方奶粉中唾液酸在体内消化情况我们还不了解。因此本文采用胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟婴儿体内消化环境，研究婴儿配方奶粉中唾液酸的消化性，并与母乳进行对比，优化婴儿配方奶粉中唾液酸的添加量，为进一步研究和开发添加唾液酸的婴儿配方奶粉提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐酸盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediaminedi hydrochloride，DMB)、Neu5Ac标准品、胃蛋白酶1∶10000、胰蛋白酶1∶250 美国Sigma公司；甲醇与乙腈(均为色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸、三氟乙酸、三氯乙酸、冰醋酸、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、β-巯基乙醇(均为分析纯)天津市光复化学精密研究所；半成品婴儿配方奶粉 内蒙古伊利乳业有限公司；唾液酸(Neu5Ac)乳品科学教育部重点实验室自制。Waters 2695高效液相色谱系统，配有可变紫外检测器和Empower色谱工作站 美国Waters公司(带荧光检测器)；依利特RP-18柱(250mm×4mm，5µm)大连依利特分析仪器有限公司；0.22µm微孔滤膜 北京优晟联合科技有限公司；K-100型超声仪 上海研永超声仪器有限公司；DKS-12型电热恒温水浴锅 上海百典仪器设备有限公司；超速离心机 上海安亭科学仪器厂；HK5干粉混合机 莱州市科达化工机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 添加唾液酸婴儿配方奶粉的制备 根据婴儿配方奶粉的干法[9]生产流程（如图1），将唾液酸与半成品婴儿配方奶粉进行干混，营养成分和感官指标均符合国家要求。配方1：唾液酸添加量为1.4kg/t；配方2：唾液酸添加量为2.1kg/t；配方3：唾液酸添加量为2.8kg/t.

图1 唾液酸干法添加工艺流程图Fig. 1 Flow chart of adding sialic acid by dry production

1.2.2 母乳样品的采集 对中国东北地区不同泌乳阶段的健康产妇随机采集三组样本，采用自动采乳机采集人乳20mL左右，将获得的人乳直接放入无菌塑料容器中，盖上乳样瓶盖，摇匀。把乳样分装到2个10毫升的离心管中，按不同阶段分成三组（每组三个样品），粘贴上统一的标签，放到离心管架上，置于-20℃冰箱中，待检。

1.2.3 体外模拟消化 体外胃的消化：配制100mL（2g）奶样，于37℃水浴锅中预热10min。加入浓度为1mol/L的HCl调pH至3，加入1 g胃蛋白酶，并不断的搅拌。水解1h，用浓度为1 mol/L的NaOH调pH至7[10]。

体外肠的消化：称取1 g胰蛋白酶，加入到上述水解液中，不断搅拌2h。到时间后沸水浴5 min灭活。冷却后放置室温，待测[10]。

1.2.4 唾液酸含量的测定 利用高效液相色谱法[11-12]测定唾液酸的组分及含量。色谱条件：色谱柱：依利特 RP-18柱；流动相：甲醇：乙腈：水＝7∶8∶85( 体积比)；荧光检测波长：373nm；柱温：30℃；流速：0.9 mL/min；进样量：10µL.

检测结果分为两部分：游离和低聚糖结合唾液酸含量的测定；蛋白质结合含量的测定。虽然唾液酸也有少部分以糖脂(神经节苷脂)的形式存在，但是其在婴儿配方乳粉中占总唾液酸含量的比例却很低(＜0.5%)，所以本研究未单独检测(包含于游离和与低聚糖结合唾液酸中)。婴儿配方乳粉中总唾液酸含量即为游离唾液酸、低聚糖结合唾液酸和蛋白结合唾液酸含量之和。

1.3 统计分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS软件进行统计分析，数据处理。除非特别说明，所有数据都是三次测试的平均值。

2 结果与分析

2.1 母乳和婴儿配方奶粉中唾液酸的浓度测定结果

根据不同阶段采集母乳样分为三组，每个样品组三个样品，母乳样组中唾液酸的含量为三个样品的平均值。

从表一中可以看出，母乳中游离、低聚糖结合唾液酸约占总唾液酸含量的 70%，蛋白质结合唾液酸约占 30%。虽然婴儿配方奶粉中唾液酸的含量接近母乳，但是唾液酸不同结合形式的比例与母乳有差别。这与这几年来的研究结果相一致[13]，即母乳中唾液酸约 70%与低聚糖结合，婴儿配方奶粉中唾液酸约 70%与蛋白质结合。干法生产添加唾液酸婴儿奶粉时，随着游离唾液酸添加量的增大，游离、低聚糖结合唾液酸在总唾液酸含量中的比例增大，蛋白结合唾液酸含量比例减小。婴儿配方奶粉3在含量和结合模式中比较接近母乳。

2.2 唾液酸在人工模拟胃肠液中的消化率

2.2.1 唾液酸在人工模拟胃液、肠液中的消化率 唾液酸在人工模拟胃液和人工模拟肠液中的消化率结果如图1、图2所示。

图2 不同样品中唾液酸的体外胃消化率Fig.2 The vitro gastric digestibility of sialic acid in different samples

图3 不同样品中唾液酸的体外肠消化率Fig.3 The vitro intestinal digestibility of sialic acid in different samples

由图2、图3可知，婴儿配方奶粉的唾液酸消化率与母乳有一定的差别。在人工模拟胃液、肠液的环境中，婴儿配方奶粉中唾液酸的消化率均高于母乳的消化率，主要表现在婴儿配方奶粉中蛋白质结合唾液酸的消化率，而游离、低聚糖结合唾液酸的消化率在母乳与婴儿配方奶粉的对比中差异不明显。这是由于婴儿配方奶粉中蛋白质结合唾液酸比例比较大，经过胃蛋白酶、胰蛋白酶的分解，蛋白质结合唾液酸消化率变化明显。

另外，从各组样品中唾液酸的体外胃、肠消化效果方面看，占总消化率的50%以上的唾液酸是在肠内进行消化分解的。因为婴儿在摄入食物1h之内，胃内pH急剧上升，最高可达6左右，远高于胃蛋白酶的最适pH，同时母乳或配方乳液在婴儿胃内一般只停留1～1.5h，便转入小肠进行进一步的消化吸收。另一方面婴儿肠道中分泌的胰蛋白酶活性高，数量也较多，婴儿摄入的蛋白只有少部分在胃中得以消化分解，大部分蛋白是小肠中得以消化吸收。因此，蛋白质结合的唾液酸在肠液中消化比胃液中消化率大。本研究中样品体外消化体系pH和消化时间均充分模拟婴儿肠胃的真实环境，所以在一定程度上模拟了唾液酸在婴儿体内的消化情况。

2.2.2 唾液酸在人工模拟胃肠环境的总消化率

图4 不同样品中唾液酸的体外总消化率Fig.4 The vitro total digestibility of sialic acid in different

从实验结果可知，3组母乳样品虽然是不同泌乳阶段，唾液酸含量不同，但总消化率差异不明显（p＞0.05）。婴儿配方奶粉1，婴儿配方奶粉2唾液酸含量达到母乳的水平，但由于蛋白质结合唾液酸比例大，总消化率远远高于母乳（p＜0.05）。婴儿配方奶粉3的总消化率虽然高于母乳的消化率，但差异并不明显（p＞0.05），表明婴儿配方奶粉3的唾液酸消化过程与母乳接近。干法生产添加唾液酸婴儿配方奶粉时，随着游离唾液酸添加量的增大，婴儿配方奶粉3在唾液酸的含量和结合模式上都与母乳接近，因此，消化情况也更接近母乳。即说明干法生产添加唾液酸的婴儿配方奶粉，添加量2.8 kg/t为最优添加量。

2.3 唾液酸在人工模拟胃肠环境中不同时点的消化率变化研究

在体外模拟胃肠反应实验中，分别在人工模拟胃液反应的10、20、30、40、50、60min取样，在人工模拟肠液的反应的10、20、30、60、90、120min取样测定其消化率,结果如图5、图6所示。

图5 唾液酸在人工模拟胃液中不同时点的消化率Fig.5 The vitro gastric digestibility of sialic acid in different time

图6 唾液酸在人工模拟肠液中不同时点的消化率Fig.6 The vitro intestinal digestibility of sialic acid in different time

由图5、图6可知，唾液酸的变化率随时间升高呈现先升后降的趋势，人工模拟胃液中在30min时达到峰值，人工模拟肠液中在60min内达到峰值。随着时间的延长，唾液酸在人工模拟胃液、肠液中的消化率均有所下降。虽然唾液酸在母乳和婴儿配方奶粉中含量有所不同，但消化率整体趋势相同。从图中还可看到，婴儿配方奶粉3的消化率变化最接近母乳。

3 结论

目前，市售婴儿配方奶粉中唾液酸的含量远远低于母乳中唾液酸含量。添加唾液酸到婴儿配方奶粉中，对于混合喂养和人工喂养的婴儿神经系统生长发育来说，是至关重要的。由于唾液酸添加量的不同，使唾液酸在婴儿配方奶粉中的结合模式与母乳存在差异。因此，通过模拟婴儿体内消化环境，对母乳和婴儿配方奶粉中唾液酸的胃肠道消化率进行对比分析，选择最优的添加量。最终得出：在母乳和婴儿配方奶粉中，唾液酸在肠内的消化率高于胃中的消化率，并且唾液酸在人工模拟胃液环境反应30min，其消化率变化最大；在人工模拟肠液环境反应 60min时，其消化率变化最大。婴儿配方奶粉中唾液酸的消化率高于母乳中唾液酸的消化率，主要表现在蛋白质结合唾液酸。当干法生产添加量为2.8 kg/t时，婴儿配方奶粉中唾液酸的消化率接近母乳。由此说明此添加量既满足生产的要求并且在消化吸收方面与母乳相似，因此为最优添加量。

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