植物乳杆菌HE-1由AI-2/LuxS介导的群体感应与生物膜形成关系的研究

张 腾，田建军，李梓媛，贾原博，贺银凤

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018)

群体感应即微生物群体感应(quorum sensing，简称QS)即细菌随着菌体密度的增大和生长周期的变化分泌出一种或几种化学信号分子，通过这些信号分子进行种内或种间交流，协调群体行为［1］。目前发现的群体感应信号分子大致有三类，其中第二类信号分子AI-2(Autoinducer-2)作为普遍存在于革兰氏阴性和阳性菌中的一种信号分子在微生物群体感应现象的研究领域备受人们的关注。

1993 年，Bassler［1］等最初在哈维氏弧菌(Vibro harveyi)中发现AI-2作为信号分子调控V.harveyi的生物发光现象，这是AI-2首次被人们所知。luxS基因作为细胞内合成AI-2信号分子的关键基因，经常被用作证明AI-2信号分子的存在。在发现信号分子AI-2之后的十几年里，陆续在大约70多个种属的微生物基因组中发现luxS基因的同源序列并检测到信号分子 AI-2［2］。

近几年的研究发现，AI-2/LuxS群体感应系统在很多种属微生物的生物膜形成过程中均起到至关重要的作用。在嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中luxS的突变菌株由于不产生AI-2信号分子，其生物膜的合成受到了影响，与野生型相比对肠上皮细胞的粘附性下降了58%［3］。粪肠球菌V583(Enterococcus faecalis V583)在外源添加AI-2信号分子之后，其生物膜的合成量增加了23%［4］。变形链球菌UA159(Streptococcus mutans UA159)的 luxS基因突变株与野生型相比包括与生物膜形成相关的大量基因表达量均有所下调［5］。

植物乳杆菌HE-1分离自内蒙古锡盟地区的酸马奶酒，本实验室前期的研究发现该菌种具有产抑菌物质、发酵大量产酸和产游离氨基酸能力强等优秀的特性，具有作为益生菌开发肠道益生产品的潜质。本实验对植物乳杆菌HE-1生物膜形成与AI-2/LuxS群体感应相关关系进行研究，以期找到其生物膜形成与AI-2信号分子产生二者之间的规律，为利用AI-2/LuxS群体感应调控生物膜大量生成打下理论基础，进而为植物乳杆菌HE-1日后被开发利用为肠道益生菌做准备。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

VICTOR X3 Multilabel Plate Reader 美国Perkin Elmer仪器有限公司;Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪 美国Thermo公司;96孔酶标板 美国Corning公司;MRS培养基 广东环凯公司。

2216海生菌培养基 青岛海博公司;细菌基因组提取试剂盒 北京天根公司;rTaq酶 Takara公司;氨苄抗性pMD19-T质粒 北京全式金公司;引物合成与测序服务 北京中美泰和公司。

1.2 菌种的保藏和活化

将植物乳杆菌HE-1接种于MRS培养基中活化三代，在第三代生长到对数期的发酵液中加入甘油至终浓度为20%，分装入1.5mL离心管置于-20℃冰箱进行保藏。每次使用按1%的接种量接种于新鲜MRS培养基中，连续活化三代可用于实验。Vibro harveyi BB170使用2216海生菌培养基活化三代，在第三代生长到对数期的发酵液中加入甘油至浓度为20%，分装入1.5mL离心管置于-80℃冰箱进行保藏。每次使用按1%的接种量接种于新鲜AB培养基［6］中，过夜培养后可用于实验。

1.3 AI-2信号分子的检测

活化三代后的植物乳杆菌HE-1按1%接种量接种于新鲜MRS培养基中。从3h至30h，每隔3h取5mL发酵上清液，600r/min离心5min后使用0.22μm过滤器过滤，置于-20℃冰箱保存备用。与此同时每隔两小时测定一次OD600nm吸光度值并绘制生长曲线。

发光检测实验方法据文献［6］得到。30℃条件下，将Vibro harveyi BB170接种于AB培养基中有氧过夜培养。当培养基OD600nm吸光度值为1左右时，按照1∶5000比例稀释到新鲜AB培养基中，混匀备用。将上述制备好的菌株HE-1各时间点发酵上清液与稀释后含有Vibro harveyi BB170的 AB培养基按照1∶100的比例混匀。在AB培养基阴性对照荧光强度最低点时(大约混匀后3.5h)使用多功能酶标仪的化学发光模式对各样品荧光强度进行测定，每个样品3个平行，每个平行均取复孔。得到各样品荧光强度后计算其相对荧光强度(相对荧光强度=样品荧光强度/AB阴性对照)。

1.4 生物膜形成的检测

生物膜检测实验方法参见文献［5］。简而言之，生物膜形成装置为96孔酶标板，每孔加入200μL新鲜MRS培养基，按照1%比例接种菌株HE-1至每个孔中，37℃静置培养。分别于 6、12、18、24、30h 将对应孔中发酵液倒出，使用生理盐水小心冲洗微孔，重复3次。待酶标板晾干之后使用浓度为1%的结晶紫染液对微孔染色15min，之后再使用生理盐水小心冲洗3次。再次晾干之后使用200μL乙醇和丙酮体积比为4∶1的脱色剂对附着于生物膜上的结晶紫染液进行脱色后，酶标板置于酶标仪OD595nm下测定吸光度值，记录数值，每个时间点三个平行。

1.5 DNA的提取与luxS基因的扩增

使用细菌基因组提取试剂盒对植物乳杆菌HE-1的基因组DNA进行提取，提取方法详见试剂盒说明书。上述提取出的DNA作为模板，luxS基因扩增使用引物为luxS-F(5'-ATGGCTAAAGTAGAAAGTT-3')和 luxS-R(5'-CTATTCAACGACTTTGCGT-3')。PCR反应体系为:0.25μL Taq;5μL 10×PCR Buffer;4μL dNTP Mixture(各 2.5mmol/L);1μL 模板(约50ng/μL);正反向引物各加 0.5μL(20μmol/L);加去离子水补齐体系至50μL。反应条件:94℃预变性3min;每个循环中在94℃下变性30min，55℃下退火30min，72℃延伸1min;30个循环;最后72℃补充延伸10min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带在500bp左右。使用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，胶回收产物与pMD19-T质粒连接后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。经蓝白斑和卡那抗性筛选后，选出阳性克隆进行菌落PCR鉴定，将鉴定结果正确的单克隆菌株送测序。植物乳杆菌HE-1的luxS基因片段已在Genbank上注册，登录号为KC914585。

1.6 同源性分析与系统发育树的构建

利用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，将所测定菌株的 luxS基因序列，与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的luxS序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种。后从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中选取不同标准菌种luxS基因序列。将参比序列与测定菌株的 luxS序列，分别用Clustal1.8进行校准排齐，使用MEGA5.1的最大似然法(maximum likelihood，ML)绘制系统发育树。

2 结果与分析

2.1 AI-2信号分子检测及与生物膜形成之间的相关关系

从图1的折线趋势可以看出，AI-2信号分子从菌株HE-1培养到9h时开始产生，在18h处的生成量达到最大值，相对荧光强度达到62.7。之后由AI-2信号分子诱导的荧光强度开始较为迅速的减弱，在培养至30h的发酵上清液中则基本没有AI-2信号分子存在。

图1中柱状图即为不同培养时间菌株HE-1生物膜的生成量。从12h处可以较为显著的检测出生物膜已经开始生成，在12h到18h之间生物膜的合成活动最为旺盛，18h处由生物膜结合而释放出来的结晶紫染液的OD595nm吸光度值达到1.337。从18h到30h，生物膜的合成活动基本停止，生物膜的总量也趋于稳定。

图1 菌株HE-1生物膜合成与AI-2信号分子生成二者之间的关系Fig.1 The relationship between the production of AI-2 and the biofilm formation

结合菌株HE-1的AI-2信号分子产生规律和生物膜合成的趋势可以看出，AI-2信号分子在12h到18h达到生成的高峰期，巧合的是与此同时生物膜也进入合成的高峰期，二者的生成量在时间点上非常相似与吻合。结合图2可以看出，二者均为培养至稳定期初期约12h处开始大量产生，到18h时生成量基本达到最大值。不同的是，AI-2在达到最大生成量之后在发酵上清液中的数量开始迅速减少，而生物膜的存在量较为稳定。在鼠李乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus)中，luxS突变株的生物膜合成量不到野生型菌株的20%，当往luxS缺陷株转化带有启动子的luxS序列之后，生物膜的形成得到很好的回补，证明luxS基因在Lactobacillus rhamnosus GG生物膜的形成中起到关键的作用［7］。故从前人研究成果和以上结果可以看出，在菌株HE-1中AI-2生成的时间趋势与生物膜合成的趋势有较大的相关性，并且产生时间基本都在稳定期初期，可以推测生物膜的合成与AI-2的调控作用有较为密切的关系。

图2 菌株HE-1不同培养时间OD600nm吸光度值Fig.2 The OD600nmabs of HE-1 in different incubation time

2.2 luxS基因的扩增及同源性和系统发育分析

以植物乳杆菌HE-1基因组DNA作为模板，使用引物luxS-F和luxS-R进行PCR扩增，扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在500bp左右有目的条带，与NCBI公布的植物乳杆菌luxS基因大小一致。

图3 luxS基因的PCR扩增结果Fig.3 PCR amplication of the luxS gene

如图4可知，植物乳杆菌HE-1的luxS序列与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Enterococcus faecalis V583和大肠杆菌 O103∶H2(Escherichia coli O103∶H2)等菌株的luxS序列同源性均小于60%。而与其他乳杆菌属的luxS基因序列同源性均大于66%，其中与 Lactobacillusplantarum WCFS1和Lactobacillus plantarum ZJ316菌株luxS基因的同源性分别为99.4%和99%。由图5可以看出，不同菌种的luxS基因序列的同源性进化距离较远，进化树中有3个大类群，乳杆菌属所有luxS基因均在第一类群中，其中菌株HE-1、Lactobacillus plantarum WCFS1和Lactobacillus plantarum ZJ316均在最上端小分支中，进化距离很相近。故可知植物乳杆菌HE-1的luxS基因是从乳杆菌属亲缘关系较近的菌种进化而来，并与植物乳杆菌同源性最高。

图4 菌株HE-1 luxS基因同源性分析Fig.4 luxS gene homologous analysis of HE-1

图5 菌株HE-1 luxS基因系统进化树的构建Fig.5 Phylogenetic tree of HE-1 constructed based on luxS sequence analysis

luxS基因是原核微生物的独有基因，它翻译出的蛋白LuxS作用于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代谢途径的下游，LuxS蛋白普遍被人们认为用来合成AI-2信号分子。故对luxS基因进行扩增并分析其同源性，可以从分子生物学的角度进一步验证AI-2信号分子的产生。

3 结论

3.1 实验首次验证了在Lactobacillus plantarum中，生物膜的形成与AI-2的生成二者之间有着密切的关系。通过检测菌株HE-1在培养不同时间点AI-2信号分子的产生量和不同时间点生物膜的形成量，发现二者之间在开始产生的时间和数量上都非常相似和吻合，故推测菌株HE-1生物膜的形成与AI-2/LuxS群体感应系统有较为密切的关系。

3.2 成功扩增出植物乳杆菌HE-1的luxS基因，同源性及系统发育分析显示其与已知植物乳杆菌luxS基因同源性高达99%以上，从分子生物学角度验证了植物乳杆菌HE-1可以产生AI-2信号分子。

［1］Melissa B M，Bonnie L B.Quorum sensing in bacteria［J］.Annual Review of Microbiology，2001，55(1):165-199.

［2］Colin A L，Tobin J D，Kim D J.Interspecies and interkingdom communication mediated by bacterial quorum sensing［J］.Chemical Society Reviews，2008，37(7):1337-1346.

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［4］Shao C L，Shang W，Yang Z，et al.Lux S-Dependent AI 2 Regulates Versatile Functions in Enterococcus faecalis V583［J］.Journal of Proteome Research.2012，11(9):4465?4475.

［5］Inigo L，Arana A T，Jaione V，et al.The Enterococcal Surface Protein，Esp，IsInvolved in Enterococcus faecalis Biofilm Formation［J］.Applied and Environment Microbiology.2001，67(10):4538-4545.

［6］张腾，贺银凤.坚强肠球菌SQ-3-2基于LuxS群体感应系统信号分子AI-2的检测及方法优化［J］.食品与发酵工业，2013，29(2):168-173.

［7］Vanderleyden J，Lebeer S，Keersmaecker S C J De，et al.Functional Analysis of luxS in the Probiotic Strain Lactobacillus rhamnosus GG Reveals a Central Metabolic Role Important for Growth and Biofilm Formation［J］.Journal of Bacteriology，2007，189(3):860-871.