ATP1A1在结肠腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

韩 娜，张彦彦，张中冕，张 芳，张 相，赵文超

(1.郑州大学第二附属医院肿瘤科，河南 郑州 450014；2.郑州大学基础医学院生理学与神经生物学系，河南 郑州 450001)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别排在第2位和第5位［1］。大部分CRC患者确诊时已经处于局部进展期，造成了CRC患者的预后较差，5 a生存率较低［2-3］。因此，寻找有效的生物预测指标和治疗靶点对于CRC的防治具有重要的意义。CRC分为结肠癌和直肠癌，其中95%以上的结肠癌属于结肠腺癌(colonic adenocarcinoma，COAD)。Na+/K+转运ATP酶α亚单位1(ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 1，ATP1A1)是Na+/K+转运ATP酶的主要成分之一［4］。研究［5-7］表明，ATP1A1在多种肿瘤中的表达发生了改变，与肿瘤的发生发展有着密切的关系。但是，ATP1A1在COAD组织中的表达及其作用并不清楚。本研究采用实时荧光定量PCR检测了ATP1A1在COAD组织中的表达，并分析了ATP1A1的表达与COAD患者临床病理特征和预后的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料选择2012年11月至2014年12月期间于郑州大学第二附属医院进行手术治疗的患者作为纳入对象。纳入标准：1) 原发肿瘤；2) 符合COAD在WHO中的诊断标准；3) 临床及随访资料完整。排除标准：1) 既往有恶性肿瘤病史；2) 术前行放、化疗；3) 合并其他恶性肿瘤或林奇综合征。根据上述标准，共纳入166例COAD患者。手术切除后的COAD组织以及配对的癌旁组织标本(距离肿瘤边缘≥3 cm)保存于-80 ℃低温冰箱中。男103例，女63例；年龄19～87岁，中位年龄63.0岁，其中≤65岁85例，>65岁81例。肿瘤分级、TNM分期按照国际抗癌联盟/美国癌症联合会2017年第8版CRC分期标准：高中分化99例，低分化67例；T1+T2期34例，T3+T4期132例；N0期84例，N1+N2期82例。电话随访截至2019年1月1日。本研究经郑州大学第二附属医院伦理委员会审查后批准，所有患者或家属均签署了知情同意书。

1.2 主要试剂Trizol Reagent购自美国Invitrogen 公司，反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit购自日本Takara公司，FastStart ESSENTIAL DNA GREEN MASTER购自瑞士Roche公司，上、下游引物由中国生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 组织总RNA的提取及反转录将COAD组织样本研磨成粉后加入Trizol裂解，加入氯仿沉淀蛋白后离心取上清，加入异丙醇沉淀RNA，体积分数75%乙醇洗涤并离心沉淀RNA 2次，无酶水溶解RNA沉淀后测定浓度，按照说明书采用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit进行反转录获取cDNA。

1.4 实时荧光定量PCR配制20 μL反应体系：10 μL荧光染料(FastStart ESSENTIAL DNA GREEN MASTER)，上下游引物各4 μL(终浓度均为0.4 μmol/L)，反转录产物0.4 μL，无酶水1.6 μL。反应过程如下：94 ℃预变性10 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40个循环。以GAPDH作为内源参照，计算2-△△CT作为基因的表达水平。ATP1A1引物序列如下：上游：5’-ACAGACTTGAGCCGGGGATTA-3’，下游：5’-TCCATTCAGGAGTAGTGGGAG-3’。GAPDH引物序列如下：上游：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

2 结果

2.1 ATP1A1在COAD组织和配对的癌旁组织中表达的比较与癌旁组织(5.70±5.87)相比，ATP1A1在COAD组织中的表达显著降低(2.96±3.98，t=4.966，P<0.001)。

2.2 ATP1A1的表达与COAD临床病理特征的关系以0.945 543为界值，将166例COAD患者分为ATP1A1低表达组(≤0.945 543)和ATP1A1高表达组(>0.945 543)。COAD组织中ATP1A1的表达与肿瘤大小(χ2=5.537，P=0.019)、浸润深度(χ2=5.326，P=0.021)和远处转移有关(χ2=5.103，P=0.024)。见表1。

2.3 ATP1A1的表达与COAD患者生存的关系ATP1A1低表达组COAD患者的中位生存时间[42.062(95%CI：37.355～46.770)个月]显著低于ATP1A1高表达组COAD患者[52.099(95%CI：48.729～55.470)个月，χ2=9.954，P=0.002]。见图1。

2.4 ATP1A1是COAD的独立预后因素单因素COX回归模型分析显示，年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、病理分级、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、ATP1A1表达均是COAD患者的预后因素。多因素COX回归模型分析表明，肿瘤位置、病理分级、远处转移、ATP1A1表达是COAD患者的独立预后因素，其中低表达ATP1A1预示着COAD患者的较差预后。见表2、3。

表3 多因素COX回归模型分析结果

3 讨论

Na+/K+转运ATP酶又叫做钠泵，广泛存在于机体的细胞膜上，具有分解ATP进而主动跨膜转运Na+和K+的功能。钠泵由α亚基、β亚基以及FXYD蛋白组成，其中α亚基分为4种亚型，即α1、α2、α3和α4，α1亚基也就是ATP1A1，在真核细胞中的表达最为广泛［8-9］。研究［9-11］表明，ATP1A1参与了多条依赖于酪氨酸激酶的细胞信号转导途径，最终影响了细胞的多种生物学功能。在肿瘤中的研究［9,12-17］发现，ATP1A1在食管鳞癌、肝癌、肺癌及神经胶质瘤中的表达增加，在肾癌中的表达降低，促进了相应的肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，参与了肿瘤的发生、发展。但是，ATP1A1在COAD组织中的表达及其作用并不清楚。

我们的研究发现，ATP1A1在COAD癌组织中的表达显著降低，表明ATP1A1在COAD的发生、发展中起到了重要的作用，同ATP1A1在肾癌中的作用相似［17］。临床病理特征相关性的研究发现，我们发现ATP1A1的表达与肿瘤大小、浸润深度和远处转移有关。这一结果表明，ATP1A1的表达降低可能具有促进肿瘤生长和侵袭转移的作用。在肾癌的研究［17］表明，ATP1A1可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，与本研究的结果相一致。但是，在食管鳞癌、肝癌、肺癌及神经胶质瘤的研究［9,12-16］中发现，ATP1A1在肿瘤组织中的表达增加，并且ATP1A1可以促进相应的肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，与本研究的结果完全相反。这种不一致性可能与肿瘤的组织特异性有关。

本研究结果还发现，ATP1A1低表达COAD患者的生存时间较短，ATP1A1是COAD患者的独立预后因素，表明ATP1A1可能是COAD患者预后的潜在标志物。

综上所述，ATP1A1在COAD组织中的表达降低，可能具有促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移的作用，从而参与了COAD的发生、发展，缩短了患者的生存时间。因此，ATP1A1不仅是影响COAD患者预后的可能独立因素，也有望成为治疗COAD的潜在靶点。