LXRs/ABCA1调控视网膜色素上皮细胞炎症反应改善脂质过氧化引起的凋亡反应

谢丽蓉 顾青 尹莉莉

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一种进行性中心视力损害性疾病，是发达国家老年人不可逆盲的主要原因。由于经济的发展和人口的老龄化，近年来在国内的发病率也不断攀升[1]。AMD的发病机制错综复杂，流行病学调查显示，多种脂质生物学功能相关的遗传变异与AMD相关[2]；代谢组学分析发现脂肪酸代谢通路是AMD发生发展相关通路[3]。此外，干性AMD的重要病理特征-玻璃膜疣内富含脂质，提示脂质代谢紊乱是AMD病理改变的重要因素[4]。脂质代谢失调引起视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)和Bruch膜内脂质堆积，在黄斑的高氧化应激环境下氧化为氧固醇[5]，进一步沉积形成玻璃膜疣[6]。氧固醇具有促炎作用，炎症反之促进玻璃膜疣的形成和RPE细胞变性，加快AMD的发生发展[7]。本课题组前期研究发现氧固醇的一种7-酮胆固醇沉积于视网膜，引起视网膜炎症和感光细胞功能障碍，进而导致AMD样变的发生和发展[8]。

LXR属于核受体超家族，包括LXRα和LXRβ，是哺乳动物脂质稳态的关键调节因子，调控各个组织胆固醇的摄取、转运、外排[9]，对炎症的调节也有重要作用[10]。已有研究表明激活LXR可以上调ABCA1、ApoE等载脂蛋白的表达，增加胆固醇外流，促进胆固醇逆向转运[11]。此外，研究发现LXR激活后可抑制肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白1、一氧化氮合酶等炎症因子表达[12]，LXR激动剂可通过NF-κB信号通路减少Amyloid β对视网膜的炎症作用[13]。本研究拟探讨LXR激动剂对视网膜过氧化脂质堆积的调节和炎症改善作用，并探究其机制，为视网膜脂质沉积变性的治疗提供更多可能性。

资料与方法

一、材料

实验研究。(1)ARPE-19细胞：购自美国模式菌种收集中心(ATCC)；(2)药物试剂：胎牛血清、抗菌素(Gibco，德国)；GW3965(Selleck公司，美国)；7-酮胆固醇、油红O、DMSO、Trition X-100(Sigma公司，美国)；LXRα、LXRβ、ABCA1抗体(Abcam公司，英国)；lipo2000(Thermo公司，美国)；7-酮胆固醇抗体(Novus biologics公司，美国)；siLXRα、si LXRβ(河马生物，浙江)；micro syringe、needle(Hamilton，美国)；CY3标记山羊抗兔二抗(Jackson，美国)；山羊血清(博士德生物，武汉)；DAPI(碧云天)；Annexin-V/PI试剂盒(Biosharp，中国)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，中国南京)

二、方法

1.细胞培养：ARPE-19细胞购自ATCC，培养于含有10%胎牛血清、2 mmol / l谷氨酰胺、100 IU / ml青霉素和100 μg/ ml链霉素的DMEM/F12培养基，置于5%CO2的湿润培养箱中。更换培养基并及时传代，取生长状态良好的第5～8代细胞进行后续实验。

2.CCK-8筛选药物最佳浓度：将ARPE-19细胞悬液(100 μl/孔)接种于96孔板中，置入培养箱中培养24 h；分别加入不同浓度激动剂GW3965(1.5 μM、2 μM、2.5 μM、3 μM)，将培养板置于培养箱中孵育48 h；取出后，CCK-8作用2 h，用酶标仪测定各组在450 nm处的吸光度。

3.7-酮胆固醇免疫荧光染色：ARPE-19细胞悬液加入24孔板中，分为4组，control、DMSO、GW3965、7 kCh组，待细胞生长融合至70%，更换无血清培养基24 h，然后分别加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，除control组以外添加7 kCh(20 μM)培养24 h。弃去培养基，无菌PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3遍。10%山羊血清室温封闭2 h，PBS洗3次，孵育7 kCh(1:100)一抗4 ℃过夜。CY3标记荧光二抗(1:500)室温孵育2 h，DAPI复染30 min，莱卡共聚焦荧光显微镜(Leica TCS NT，Wetzlar，Germany)拍照。

4.油红O染色：ARPE-19细胞悬液加入放好爬片的24孔板中，分为4组，control、DMSO、GW3965、7 kCh组，待细胞生长融合至70%，更换无血清培养基24 h，然后分别加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，实验组均置于含7 kCh(20 μM)培养24 h。弃去培养基，PBS漂洗3次，4%4 ℃多聚甲醛固定20 min。PBS再次漂洗2次，油红O(0.3 g/mL)37 ℃染色20～30 min。60%异丙醇漂洗5 s，然后立刻PBS漂洗2～3次。苏木素复染40 s，水洗2～3 min，显微镜(Olympus BX53，日本)下观察。

5.siRNA转染分别敲低LXRα、LXRβ表达：ARPE-19分为6组，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ组，待细胞生长融合至50%，更换无血清培养基，分别加入混有siLXRα或siLXRβ RNA与lipo2000的试剂，转染6 h后更换血清培养基作用24 h，然后分别加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，将后四组置于含7 kCh(20 μM)培养基中培养24 h。

6.qPCR检测ARPE-19细胞内IL-1β、Caspase 1的表达：ARPE细胞分为6组，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ组，如前所述转染，然后分别加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，于含7 kCh(20 μM)培养基培养24 h。Trizol提取各组RNA，用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix逆转并扩增。检测时每个样品设置两个副孔，并计算平均Ct值作为最终Ct值，以actin作为内参将数据标准化,每组实验重复3次，引物序列见表1。

7.Annexin-V/PI染色检测ARPE-19细胞凋亡：ARPE细胞分为6组，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ组，如前所述转染，然后分别加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，置于7 kCh(20 μM)培养基中培养24 h。胰酶消化得到6组单细胞悬液(106/ml)，加入荧光染料37 ℃孵育30 min，流式细胞仪(CYTOFLEX；贝克曼库尔特公司，美国)检测，激发光波长488 nm，515 nm滤器检测FITC荧光，570 nm滤器检测PI。

结 果

一、筛选激动剂最佳浓度

CCK8结果显示：GW3965浓度在1.5、2 μM时对RPE细胞的增殖活力没有明显影响，当浓度大于2.5时细胞增殖活力随浓度上升而下降(图1)。

不同浓度GW3965作用下ARPE-19细胞CCK-8检测

二、LXRs激活减少RPE细胞7-酮胆固醇堆积

C、O：7 kCh染色阴性；G、K：7 kCh染色阳性；D：RPE细胞内无脂滴沉积；H、L：RPE细胞内大量脂滴沉积；P：RPE细胞内几乎无脂滴沉积。

ARPE-19细胞免疫荧光染色显示：与未经 7 kCh处理的control组相比，7 kCh组RPE细胞内免疫阳性细胞增加(图2C、K)，表明7 kCh沉积在RPE细胞中；用激动剂GW3965处理的细胞与DMSO处理的对照组相比，细胞内阳性颗粒减少，说明GW3965减少7 kCh在RPE细胞中堆积(图2G、O)。油红染色也证实了这一点：control组细胞内脂滴较7 kCh组少(图2D、L)，DMSO组与7 kCh组细胞内脂滴无明显差异(图2H、L)，GW3965组细胞内脂滴比7 kCh、DMSO组明显减少(图2H、L、P)，表明LXR激动剂处理减少7 kCh在RPE细胞中堆积。

图2 免疫荧光及油红O染色检测RPE细胞内脂质沉积情况

三、LXRs激活减少RPE细胞凋亡

LL，活细胞：Annexin V阴性/PI阳性；LR，早期凋亡细胞：Annexin V阳性/PI阴性；UR，晚期凋亡细胞：Annexin V阳性/PI阳性;UL，坏死细胞：Annexin V阴性/PI阳性。每个象限中的数字代表细胞出现在该象限的百分比。

ARPE-19细胞Annexin V/PI检测显示：与control组相比，7 kCh、DMSO组凋亡细胞分别上调9.94%、9.62%(图3A、B、C)；GW3965与7 kCh共同作用RPE细胞后，凋亡细胞较control组仅上调1.92%(图3D)，表明GW3965减少7 kCh诱导的RPE细胞早期凋亡；敲低LXRα同时7 kCh培养RPE细胞，早期凋亡细胞增加19.46%(图3E)，而敲低LXRβ同时7 kCh培养RPE细胞，早期凋亡细胞与7 kCh组无明显差异，但晚期凋亡细胞明显增加(图3F)。

图3 Annexin V/PI染色检测ARPE-19细胞早期凋亡

LXRs激活ABCA1、减少7 kCh引起的IL-1β和Caspase 1上调

A-E：DMSO、7 kCh、GW3965、siLXRα、siLXRβ分别与control组比较

q-PCR结果显示：LXR激动剂增加LXRα、LXRβ、ABCA1表达量(图4A、B、E)，说明LXR激动剂可以增加ABCA1的表达；7 kCh作为LXRs的配体，对LXRs同样有激活作用(图4A、B)；7 kCh增加RPE细胞内Caspase1、IL-1β表达，而LXR激动剂减少7 kCh引起的这种反应(图4C、D)；抑制LXRβ表达后，Caspase1、IL-1β表达量增加，而抑制LXRα后，与7 kCh组相比，Caspase1、IL-1β表达量无明显变化(图4C、D)，说明在此炎症通路中LXRβ起主要抑制作用。

图4 RT-PCR检测ARPE-19细胞LXRα、LXRβ、ABCA1、caspase1、IL-1β表达

讨 论

脂质异常与AMD的发生发展密切相关[14]。脂质代谢在视网膜受到精密的调节，其失调可引起RPE细胞和Bruch膜内脂质蓄积[4]。RPE细胞内氧化脂质累积引起炎症发生，POS吞噬代谢受阻，诱发RPE细胞功能障碍，感光细胞凋亡。黄斑区高氧化环境促进过度蓄积的脂质过氧化，RPE的抗氧化能力随着年龄的增长逐渐降低，进而诱发炎症，导致AMD进展[5]。RPE细胞在眼内脂质代谢调节中起重要作用。RPE细胞表达多种脂蛋白，加工、修饰、降解来自全身和眼内局部的脂质。RPE细胞分泌apoB100，避免脂质积累引起凋亡损伤[15，16]。同时，RPE细胞具备主动胆固醇逆向转运系统，线粒体胆固醇逆向转运蛋白(TPSO)增加胆固醇从RPE细胞到ApoE、ApoI和HDL的流出，并且随年龄增长，TPSO分泌减少[17]。过度蓄积的氧化脂质可以诱导一系列炎症因子合成，包括TNFα、IL-1β、IL-6等[18]，并显著增强1-42淀粉样蛋白对人神经元的促凋亡和坏死作用[19]。我们以往报道了玻璃膜疣的重要成分7-酮胆固醇致炎作用并导致感光细胞功能障碍，促进视网膜发生AMD样病理改变[8]。

LXR是一种配体激活的核转录因子，广泛存在于全身各个细胞、器官。研究发现，LXR参与脂质代谢的调节，同时也调控体内多种炎症因子的表达而参与炎症反应，与AMD发生关系密切[20]。LXR调节RPE顶端和基底膜的ABCA1表达，参与RPE脂质代谢的调节，维持RPE脂质代谢稳态，该通路受损可引发视网膜膜脂紊乱[21]。LXRα缺失导致小鼠视功能受损，视网膜外层脂质累积和炎症因子的上调[22]。另外，LXRα-ABCA1轴可缓解Aβ1-40诱导的RPE细胞炎症和衰老反应[13]。过氧化脂质诱导RPE细胞炎症发生，我们推测LXR是RPE细胞脂质代谢与炎症调节的中心，可能成为干性AMD的潜在治疗靶点。

本研究证实，GW3965通过同时激活LXRα、LXRβ，上调ABCA1表达，促进RPE细胞内脂质代谢与清除。LXRs的激活不仅减少过氧化脂质堆积，并减少RPE细胞凋亡。同时，GW3965通过调节LXRβ-Caspase1-IL-1β，导致RPE细胞晚期凋亡、坏死，而LXRα则与RPE细胞早期凋亡关系更密切。综上所述，LXRs通过调节RPE细胞脂质代谢，改善氧化脂质对RPE细胞的损伤，并通过LXRβ-Caspase1-IL-1β通路减少RPE保护RPE细胞。但LXRα通过何种途径减少RPE早期凋亡的机制仍不清楚，两种分型对脂质代谢的调节作用有何异同也暂不清楚，有待进一步观察和研究。