健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、 铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌杀菌效果的研究

刘菁，丁淑琴，张玮，张怡清，贺嘉夫茹孜

(宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)

0 引言

近年来，高校实验室安全事故频繁发生，不仅威胁师生的生命安全，也给社会带来了一定的负面影响。实验室安全包括水、电、危险化学品、消防、生物安全等方面，尤其是生物安全，一旦出现菌种泄露，带来的危害将无法预估。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌作为实验室常用的实验教学菌种，如果选择不合适的消毒剂，其消毒效果不能完全杀灭细菌，菌种会被学生带出实验室，造成菌种泄露，危害师生生命安全。此外，消毒剂质量的良莠不齐也将导致消毒效果不能达到如期效果。

健之素是中华预防医学会推荐使用的广谱高效消毒剂[1]，其对不同的菌种消毒效果均不相同，而且其浓度随着配置时间的延长逐渐降低。因此，研究了健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌五种不同菌种的杀菌结果，观察健之素的消毒效果，为防止菌种泄露，保障实验室的生物安全提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

健之素(北京长江脉医药科技有限责任公司，产品批号201022W，有效含量250±25mg/每片)；硫代硫酸钠；pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)；有机干扰物为3%的牛血清白蛋白；营养肉汤；营养琼脂；哥伦比亚血琼脂；生理盐水；胰蛋白胨。

1.2 菌种和菌悬液的制备

大肠埃希菌菌(44155)、铜绿假单胞菌(10102)、肺炎克雷伯杆菌(46117)、阴沟肠杆菌(ATCC700323)和鲍曼不动杆菌(ATCC19606)由本实验室保存。常规复苏细菌，并经正常传代2～3次后使用。将细菌接种至哥伦比亚血琼脂平板上，37℃培养至对数生长期，从琼脂哥伦比亚血平板中挑选几个菌落直接在无菌生理盐水中制成菌悬液，校准菌悬液浊度为0.5麦氏单位(含1×108CFU/mL)。

1.3 中和剂鉴定试验

选择大肠埃希菌做中和剂鉴定试验。将大肠埃希菌制成含有机干扰物质的菌悬液(细菌浓度1×108CFU/mL)。试验分6组，按2002版《消毒学技术规范》中和剂悬液定量鉴定试验程序进行。试验在常温下，重复3次。

1.4 最低抑菌浓度(MIC)检测

用微量肉汤稀释法[2]检测健之素的最小抑菌抑菌浓度。将健之素用营养肉汤做倍比系列稀释后加入试验孔(100μL/孔) 后，每孔加入细菌悬液10μL(细菌终5*104CFU/mL)。将相同浓度细菌接种于肉汤(100μL/孔)的培养基中为阳性对照。只含有等体积培养基的试验孔为阴性对照。将已接种的微量稀释盘置于(35+2)℃孵育箱孵育16-20h。为保持所有培养物的孵育温度相同，重叠放置的微量稀释盘不应超过4个。为防止干燥，应将稀释盘用塑料袋密封。试验在常温下，重复3次。

1.5 最低杀菌浓度(MBC)检测

采用琼脂平板法检测最小杀菌浓度。最小抑菌浓度检测完后，取肉眼清亮实验孔液体做平板划线，每份样液接种2个培养孔，结果取均值。置于(35±2)℃孵育箱孵育16-20h后计数各组平板上的菌落数。

1.6 悬液定量杀菌试验

将细菌悬液和3%BSA等比例混合，制备含有机干扰物质的细菌悬液(细菌浓度为5×107/mL)，置20℃±1℃水浴中备用。实验在48孔微孔板中进行。在已含有倍比稀释健之素的微孔(400μL/孔)中，分别加入含有机干扰物质的细菌悬液(100μL/孔)作用不同时间(5min、10min、15min、20min、25min、30min)。取出混合液(50μL/孔)加入到已含中和剂(450μL/孔)的试验孔中。作用10min后，每孔分别吸取100μL，接种培养平板每份样液接种2个培养孔，结果取均值。同时，用无菌水代替消毒液作为阳性对照。用水代替碘伏和细菌的试验孔为空白对照。试验板置于(35+2)℃孵育箱孵育48h后观察最终结果，计数各组菌落数(CFU/mL)。试验在常温下，重复3次。

2 结果

2.1 中和剂鉴定试验

试验结果以第1组无试验菌生长，或仅有极少数试验菌菌落生长，第2组有较第1组为多，但较第3、4、5(组)为少的试验菌菌落生长，第3、4、5(组)有相似量试验菌生长，其组间菌落数误差率应不超过15%，第6组无菌生长为合格。含3%硫代硫酸钠的中和剂，可有效中和健之素消毒剂对大肠埃希菌的残留作用且中和剂和中和产物对试验菌生长及培养基无影响，该中和剂对健之素2000mg/L合格(表1)。

表1 中和剂鉴定实验结果

2.2 最低抑菌浓度(MIC)

结果显示，健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌的MIC均为 250mg /L。健之素对铜绿假单胞菌的MIC为125mg /L(图1)。

图1 健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌最小抑菌浓度 (MIC)结果

2.3 最低杀菌浓度(MBC)

肉眼观察琼脂平板的结果，结果如表2所示。健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌的MBC均为 250mg /L。健之素对铜绿假单胞菌的MBC为125mg /L。

表2 健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌最小杀菌浓度 (MBC)

2.4 健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌的杀灭作用

实验结果：浓度250～2000mg/L的健之素对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌分别作用5min～30min，菌落计数均为0 CFU/mL。浓度250～2000mg/L的健之素对大肠埃希菌作用5min～30min，500mg～2000mg/L的健之素可以完全杀灭大肠埃希菌，250mg健之素对大肠埃希菌的消毒效果随着作用时间的延长杀灭率达到100%。结果如图2所示。1000mg～2000mg/L的健之素可以完全杀灭阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌，250mg～500mg健之素对阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌的消毒效果随着作用时间的延长杀灭率达到100%。结果如图3和表3所示。

表3 不同浓度健之素对铜绿假单胞菌不同消毒作用时间后的细菌杀灭率(%)

图2 不同浓度健之素对大肠埃希菌在不同的消毒作用时间后生长的菌落数(CFU/mL)

图3 不同浓度健之素对阴沟肠杆菌不同消毒作用时间后生长的菌落数(CFU/mL)

3 讨论

根据2018年全国细菌耐药监测网统计，全国医院革兰阴性菌分离前五位的分别是：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌。它们在医院环境长期存活，并在医院内通过空气、飞沫、医护人员的手及各种医疗器械、辅助材料等传播流行，甚至引起医院内感染的暴发流行[3]。在医学院校，这五种细菌作为肠杆菌科和非发酵菌属的代表菌种，在《临床微生物学检验》实验课程中用于学生的实验教学。在实验中，会出现学生将菌种遗漏在桌面、地面或者个人防护用品上，如果没有选择合适的消毒剂进行消毒，菌种会被带出实验室，造成菌种泄露，严重者会影响师生生命。

健之素作为医院常用的医用消毒剂，其杀菌效果较好。健之素对不同的菌种有不同的消毒时间，而且其浓度随着配置时间的延长逐渐降低。因此本研究健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌的杀菌效果，为实验室的生物安全提供科学依据。

实验结果表明，健之素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为250mg/L。健之素对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为125mg/L。微孔板悬液定量杀灭实验显示，1000～2000mg/L健之素的消毒作用时间5min～30min，可以完全杀灭大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌。250～500mg/L健之素随着消毒作用时间的延长(延长到30min)，可以完全杀灭大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌。因此，各实验室可以使用浓度1000～2000mg/L健之素，消毒作用5min，对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌杀灭率达到100%，避免菌种泄露危害的发生，为实验室生物安全提供保障。