小柴胡汤治疗骨性关节炎的网络药理学研究

吴立蔚，许杨，李晶，陈君春，梁嘉敏，刘倩,，杨渊

(1.广西医科大学，广西再生医学重点实验室，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院，广西再生医学研究中心，广西 南宁 530021；3.广西医科大学附属埌东医院，广西 南宁 530021)

0 引言

骨性关节炎(Osteoarthritis, OA)，属中医“痹症”“骨痹”范畴，多因肝肾亏虚，气血虚弱，寒湿痹阻经络所致，是最常见的关节炎形式，在65岁以上的人群中，三分之一的人受到影响，女性比男性受到的影响更大[1]，目前对骨性关节炎患者进行治疗的时候，使用中医骨科康复治疗无论是在治疗效果、关节修复方面都具有明显的优势，有效缓解患者的疼痛感、提高他们的生活质量[2]。小柴胡汤出自东汉张仲景的《伤寒论》，是中医和解少阳的经典方剂，由柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草(炙)、生姜(切)、大枣(擘)组成，根据相关研究报道其具有抗炎、抗肝纤维化、抗肿瘤及调节内分泌等作用[3]，临床上主要运用于内科方面的治疗[4]，但尚无小柴胡汤在治疗骨性关节炎方面的研究。本研究通过网络药理学研究方法，研究小柴胡汤中治疗骨性关节炎的潜在分子机制，为了寻求更好的治疗骨性关节炎的新途径提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 小柴胡汤主要活性成分及其作用靶点的筛选

通 过TCMSP数 据 库(https：//tcmspw.com/index.php)检索小柴胡汤中柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、生姜、大枣有效活性成分[5]，获取对应的靶点。设定口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB)和类药性(Drug-likeness, DL)为基础筛选条件，选择OB值大于等于30%、DL值大于等于0.18为筛选参数，最后将获得的蛋白质靶点在DrugBank数据库(https：//go.drugbank.com/)和Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)进行检索并加以规范化，删除重复或无效数据[6,7]。

1.2 骨性关节炎相关致病靶点的筛选

运 用GeneCard数 据 库(https：//www.genecards.org/)检索“osteoarthritis”[8]，获得疾病相关靶点，并在Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)进行库检索删除重复或无效数据。结合筛选出的药物相关基因靶点利用在线作图工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，得到骨性关节炎-小柴胡汤的交集可视化韦恩图。

1.3 小柴胡汤治疗骨性关节炎的网络调控构建

将方剂各组分相关信息和交集基因靶点数据导入Cytoscape3.8.2作图分析软件，进行网络可视化分析，建立方剂-基因靶点的网络调控图，其中设置有效药物活性成分节点连接的潜在靶点数量与节点大小成正比，从中挑选突出的关键节点，对应小柴胡汤治疗骨性关节炎过程中的关键有效药物活性成分。

1.4 蛋白质互作用网络的构建与核心靶点筛选

将获得的药物作用靶点和疾病靶点数据导入Cytoscape3.8.2，使用Bisogenet插件构建药物靶点蛋白质与疾病靶点蛋白质相互作用网络(Protein-Protein Interaction, PPI)，提取交集得出交集PPI网络，使用插件CytoNCA对交集PPI网络数据进行拓扑属性分析，对各个节点在全网络中的关键性进行评估筛选出核心靶点网络。

1.5 蛋白质互作用网络关键模块的提取

使用Cytoscape3.8.2中MCODE插件对关键靶点网络进行分析，提取其中关键蛋白模块，并使用String数据库(https：//www.string-db.org/)分析作图，利用Metascape对其进行分子功能分析，以此得出可能作用的信号通路[9]。

1.6 核心靶点的生物富集和通路分析

将核心靶点基因上传DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)[10]，进行GO生物富集和KEGG通路分析，下载分析结果用R软件输入相应代码进行可视化分析。

2 结果

2.1 小柴胡汤的作用靶点

通过TCMSP数据库分别对小柴胡汤的7个成分进行查询，根据数据库参数信息设置OB≥30%和DL≥0.18为基础条件，筛选得到193个有效成分，290个对应蛋白靶点，同时将所得靶点分别导入DrugBank和Uniprot数据库里进行检索，删除重复以及无效靶点最终得到靶点265个。

2.2 小柴胡汤相关靶点

在Genecard数据库中输入“骨性关节炎”搜索到相关基因5244个，导出后通过Uniprot和DrugBank数据库检索去除无效靶点，最终得到疾病基因1304个。最后利用在线作图软件(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取疾病基因与药物靶点基因的交际图，见图1，获得交集基因133个。

图1 小柴胡汤活性成分靶点与骨性关节炎靶点韦恩图

2.3 药物-成分-疾病靶点网络

通过Cytoscape3.8.2软件构建药物成分-活性成分-基因靶点网络，其中基因以及黄芩对应的活性成分根据Degree值的中位数进行第一次筛选，然后再将甘草对应的活性成分根据Degree值的二倍中位数进行第二次筛选，得出图2，最终获得174个节点，661条连接。并将基因靶点按照Degree排序得出其编号前十对应的药物成分分别是有槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、甘草卤酮、胫骨青霉素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、美迪紫檀素，提示可能在小柴胡汤治疗骨性关节炎时发挥重要作用。

图2 药物成分-活性成分成分-基因靶点网络

表1 小柴胡汤可能发挥作用药物成分

2.4 小柴胡汤治疗骨性关节炎的PPI网络和核心靶点的筛选

运行BisoGenet插件构建小柴胡汤-骨性关节炎交集基因靶点PPI网络，最终得出节点5653个，蛋白质相互关系137483条。按二倍中位数的中介中心性(Betweenness Centrality, BC)值，接近中心性(Closeness Centrality, CC)值，二倍中位数的Degree值，进行第一次筛选，然后再按二倍中位数的Degree值，中介中心性，接近中心性的二倍中位数进行第二次筛选，得到核心靶点网络，节点31个，蛋白质互相关系260条，见图3。得到前5名核心靶点有FN1(纤连蛋白1)、APP(淀粉样前体蛋白)、CDK2(细胞周期蛋白依赖性激酶 2)、EP300(E1A 结合蛋白P300)和EWSR1(内皮细胞性骨髓肉瘤断裂点区1)等。

图3 小柴胡汤治疗骨性关节炎蛋白质互作用网络以及核心靶点图

2.5 对小柴胡汤治疗骨性关节炎核心网络的关键模块的提取

使用Cytoscape3.8.2软件中MCODE(Molecular Complex Detection)插件对核心靶点网络进行分析，提取出3个评分最高的蛋白质聚集模块，并通过Metascape在线分析网站对其进行GO分子功能分析，分析其模块可能参与的作用通路，去除无效连接，见图4。

图4 小柴胡汤治疗骨性关节炎核心网络关键模块图及分子功能分析图

2.6 核心靶点的生物富集分析及可视化

使用DAVID数据库，对核心靶点31个基因进行生物富集分析。分析核心靶点的细胞组分(Cellular Component, CC)，分子功能(Molecular Funtion, MF)，生物过程(Biological Process, BP)，并按Count值和Pvalue将结果排序即富集在该项上的靶点与核心靶点总数的比值，将排名前10的各项R软件绘制气泡图，细胞组分有：受体复合物，蛋白复合物，核，核质，细胞质等，生物过程：正调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录，细胞热反应调节，ERRB2信号通路等，分子功能：转录因子结合，蛋白结合，ATP结合，结合泛素连接酶等，见图5。同时分析KEGG通路富集分析，按Count值和P值排序，将排名前10条通路用R软件绘制气泡图，结果有Wnt signaling pathway；磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3KAKT signaling pathway)；丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)；Janus 激酶/信号转导和转录激活因子信号 通 路(JAK-STAT signaling pathway)；FoxO信 号 通 路，见图6。

图5 生物富集分析气泡图以及KEGG富集分析气泡图

3 讨论

针对OA的治疗手段从现代医学角度来看，主要的治疗方法有从自体软骨细胞植入、再生等，但是效果并不显著[11]。反观之自古以来中医学对骨性关节炎的研究就从未停止，其将外邪的致病性及内因同时纳入考虑范围，临床上运用中药方剂治疗不仅改善了临床症状，而且兼顾了疾病内在的因果，疗效确切[12]，但美中不足的是传统中医学对治疗OA的分子机制仍不明确。本研究通过充分利用全新的网络药理学的技术与理念，探究小柴胡汤在OA治疗中的核心作用靶点、信号通路和生物进程。

我们首先针对小柴胡汤的各组分利用网络药理学的研究方法进行药物-成分-疾病靶点网络分析筛选出槲皮素，山奈酚，汉黄芩素，甘草卤酮，胫骨青霉素，7-甲氧基-2-甲基异黄酮，美迪紫檀素七种有效化学成分，其中槲皮素，山奈酚均为黄酮类化合物有抗炎、抗菌等作用[13,14]，美迪紫檀素具有骨保护、抗菌、抗肿瘤等活性作用[15]，以上成分均提示存在治疗OA的潜在作用。同时筛选出来的核心靶标主要有FN1、APP、CDK2、EP300和EWSR1等，这些基因靶点通过细胞组分、生物过程、分子功能主要影响受体复合物，蛋白复合物，核，正调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录，细胞热反应调节，转录因子结合，蛋白结合，结合泛素连接酶等生物过程，FN1广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，有研究表明可激活TGF-β/PI3K/AKT促进软骨细胞分化和胶原合成[16]，从而可能影响OA的进程；在2020年E. Ristori, S. Donnini, M. Ziche等人研究发现APP的完整表达和加工是正常内皮功能所必需的[17]，CDK2则有可能参与OA的发病机制[18]，EP300和EWSR1分别通过自噬蛋白结合以促进软骨的形成以及遗传和表观学途径来对抗细胞衰老[19,20]，通过KEGG分析得出可通过Wnt，PI3K-AKT，FoxO，MAPK以及JAK-STAT信号通路进而干预OA的发生发展，Wnt信号的上调导致分解代谢酶增加、成骨细胞分化和炎症从而引起OA[21]，PI3K-AKT信号通路通过PIP3激活AKT，AKT的磷酸化可通过下游多个靶点调控软骨细胞自噬和其线粒体的融合及裂变影响OA的进程[22,23]。而且FoxO转录因子对于软骨发育、成熟、体内平衡从而影响整个骨关节炎发病机制[24]。丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(MAPK)和Janus 激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)可通过影响软骨细胞增殖、分化、凋亡、炎症以此调节软骨细胞的有害炎症刺激的表达[25,26]。

综上所述，利用网络药理学方法研究小柴胡汤作用于OA的主要机制，我们发现小柴胡汤作用于FN1、APP、CDK2、EP300和EWSR1等关键靶点，通过Wnt，PI3K-AKT，MAPK以及JAK-STAT信号通路等重要通路，发挥抗炎和抗凋亡等功能而实现对OA发病机制的干预作用，为小柴胡汤抗骨性关节炎的科学研究及应用提供理论基础。