亲环蛋白D和Caspase-3在大鼠肾脏缺血再灌注损伤 实验中关系的研究

范世成，朱元全，冯伟，李胜斌，王波，唐香，崔庆鹏*

(云南省第三人民医院，云南 昆明 650011；2.曲靖市第二人民医院，云南 曲靖 655500)

0 引言

肾脏作为机体的高灌注器官，肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是临床上急性肾功能衰竭(Acute renal failure,ARF)的重要环节，也是肾脏远期纤维化导致终末期肾功能衰竭的主要原因[1,2]。目前缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)的发生机制尚未阐明，通常认为：氧自由基、钙超载、炎症介质、细胞凋亡及多种信号通路参与了IRI的病理演变过程[3]。但随着研究的深入，细胞能量代谢障碍及由此导致的细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要原因。线粒体作为细胞的能量工厂，首先感受到能量的变化从而影响各种凋亡蛋白的表达，在缺血再灌注损伤中扮演着重要角色，因而成为目前研究缺血再灌注损伤的热点[4-6]。 线粒体功能的表达是通过位于线粒体内、外膜之间的非特异性孔道线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)来实现的，MPTP是维持线粒体稳定及细胞功能的必要条件，是线粒体与细胞质进行物质交换和信号传导的重要通道[7]。

亲环蛋白D(Cyclophilin D,Cyp-D)属于肽脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl-cis-transisomerases,PPIase)亲环蛋白家族，是Ppif基因编码的产物，主要定位于线粒体基质，是构成 MPTP关键性的调控因子，在细胞凋亡及蛋白翻译、折叠、运输过程中起重要作用[8]。大量的实验研究发现，CYP-D是引起细胞死亡的关键性损伤蛋白，是反应线粒体损伤及功能障碍的指标。CYP-D表达水平与MPTP开放数量呈显著正相关，CYP-D过度表达促进MPTP开放，组织损伤加重，而通过基因敲除或使用免疫抑制剂环孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)能抑制CYP-D表达或活性，从而减少MPTP开放，减轻组织损伤，从而认为CYP-D是抑制缺血再灌注损伤的重要靶点。

Caspase家族是存在于细胞质中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，参与调节和执行细胞凋亡最重要的蛋白酶，与线虫(caenorbditis elegans)的死亡基因Ced-3同源，根据其在细胞凋亡过程中的结构及功能，分为炎症有关、凋亡启动及凋亡效应三个亚类，其中Caspase-3是主要的凋亡效应蛋白，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，被称为“死亡执行蛋白酶”，Caspase-3一旦活化，凋亡必然发生[9]。

我们通过采用不同热缺血时间建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，通过亲环蛋白D介导的线粒体功能障碍研究肾脏IRI的作用机制，以及与Caspase-3的探明作用关系，同时作为MPTP关键性的调控因子CYP-D，可能是抑制缺血再灌注损伤的作用靶点，将为临床防止肾脏IRI和药物研究提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康成年雄性SD大鼠40只、无创血管夹、兔抗小鼠Cyp-D一抗、兔抗小鼠caspase-3一抗、组织线粒体分离试剂盒、Trizol PCR 试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

健康雄性SD大鼠40只，随机分为4个组：假手术组(Con组)、I-R20min组、I-R30min组和I-R45min组，每组10只，每组于2个时间点(再灌注后24h及28d)处死取肾，每个时间点5只，共有8个小组。

1.2.2 模型建立

实验组通过手术暴露双侧肾蒂后用无创血管夹夹闭，根据不同亚组时间分别阻断(20分钟、30分钟、45分钟)，恢复血供后可见肾脏迅速恢复鲜红色，造模成功。假手术组仅游离肾蒂，但不夹闭肾蒂，其余操作方法相同。造模成功24h及28d后，切取肾脏行矢状位切，放入液氮中速冻后，于-80℃冰箱保存备用，用于Western blot及RT-PCR检测。

1.2.3 Western blot

取肾组织线粒体，加入适量匀浆缓冲液(每100mg加入1mL缓冲液)于冰上匀浆10min，经6000×g离心5min离心后取上清液，用考马斯亮蓝试剂盒经紫外可见分光光度计测定蛋白浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳，凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。

1.2.4 RT-PCR

用Trizol提取组织样本中总RNA。取5μLRNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用TIANScript RT KIT进行反转录，用荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.2.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量数据用均数± 标准差(±s)表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cyp-D 及Caspase-3的Western blot 检测结果

图2 Western blot 检查不同热缺血时间大鼠肾缺血再灌注28d Cyp-D及Caspase-3蛋白的表达(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

图4 不同热缺血时间大鼠肾再灌注28d Cyp-D、Caspase-3 mRNA的表达(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

Cyp-D的Western blot 检测结果示，Con组Cyp-D含量少，随缺血时间延长表达增加。与Con组比较，I-R20min组Cyp-D表达上未见明显差异(P＞0.05)，I-R30min组与I-R45min组表达增加(P＜0.05)且I-R45min组增加明显(见图1、2)。Caspase-3的Western blot检测结果示，Con组Caspase-3含量少，随缺血时间延长表达增加。与Con组比较，I-R20min组Cyp-D表达上未见明显差异(P＞0.05)，I-R30min组与I-R45min组表达增加(P＜0.05)且I-R45min组增加明显(见图1、2)。

图1 Western blot 检查不同热缺血时间大鼠肾缺血再灌注24h Cyp-D及Caspase-3蛋白的表达(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

2.2 Cyp-D 及Caspase-3的RT-PCR检测结果

Cyp-D 及Caspase-3的RT-PCR检测结果示，Con组Cyp-D及Caspase-3 mRNA含量少，随缺血时间延长表达增加。与Con组比较，I-R20min组Cyp-D及Caspase-3 mRNA表达上未见明显差异(P＞0.05)，I-R30min组与I-R45min组表达增加(P＜0.05)且I-R45min组增加明显(图3、4)。

图3 不同热缺血时间大鼠肾再灌注24h Cyp-D、Caspase-3 mRNA的表达(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

3 讨论

肾脏作为机体的高灌注器官，在器官移植、阻断肾脏血流的手术、休克、心肺复苏等中IRI均不可避免[10]，是临床上急性肾功能衰竭的重要环节，也是肾脏远期纤维化导致终末期肾功能衰竭的主要原因[1,2]。因此尽早恢复组织灌流是减少缺血性肾损伤的根本措施，但在临床实践中，为了保证手术治疗目的，常需阻断肾脏血流，所以对肾脏组织无明显影响的热缺血时间一直是泌尿外科及器官移植邻域的研究热点，但由于选用动物模型、实验条件及检测指标的不同，得出的结论不完全一致，甚至相互矛盾，且大多数实验未能使用同一指标同时研究IRI对肾脏近期及远期损伤的影响，因此仍有必要研究IRI对肾脏组织细胞的影响并探讨安全的热缺血时间。随着研究的深入，细胞能量代谢障碍及由此导致的细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要原因。线粒体作为细胞的能量工厂，首先感受到能量的变化从而影响各种凋亡蛋白的表达，在缺血再灌注损伤中扮演着重要角色，因而成为目前研究缺血再灌注损伤的热点[4-6]。线粒体是真核细胞重要的细胞器，是细胞进行氧化磷酸化、呼吸链电子传递、合成ATP的重要场所，其功能的表达是通过位于线粒体内、外膜之间的非特异性孔道线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)来实现的，亲环蛋白D(CyP-D)是构成 MPTP关键性的调控因子，在细胞死亡及蛋白翻译、折叠、运输过程中起重要作用[8]，是反应线粒体结构及功能障碍的指标。本实验中，无论再灌注早期及远期均可发现，随缺血时间延长，Cyp-D蛋白及mRNA的表达均有不同程度升高，且Cyp-D在蛋白翻译及所编码基因转录水平上的结果是一致的，与Con组及I-R20min组比较，I-R30min组Cyp-D蛋白及mRNA的表达水平增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，且I-R45min组表达明显增加。这与刘长涛等[11]、斯妍娜等[12]在大鼠肾缺血再灌注损伤模型中得到的结果一致，发现随缺血时间延长，Cyp-D水平逐渐升高，MPTP的开放程度也相应增加，肾组织损伤加重，通过抑制Cyp-D的表达，可发挥保护肾脏的作用。而通过敲除、沉默Ppif基因[13-17]或使用免疫抑制剂环孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)[18-21]能抑制CYP-D表达或活性，减少MPTP开放，减轻组织损伤，从而认为CYP-D是抑制缺血再灌注损伤的重要靶点。所以CYP-D可作为反应缺血再灌注损伤程度的指标，其理由如下：

(1)缺血再灌注时，Ca+ 超载及大量ROS形成，ATP酶活性降低，ATP合成受阻，导致线粒体通透性改变及线粒体肿胀。线粒体结构及功能的破坏，是细胞再灌注不可逆损伤的重要标志。

(2)线粒体功能的表达是通过MPTP来实现的，细胞凋亡和细胞坏死常取决于MPTP开放的程度及持续时间的长短，MPTP短暂少量开放，引起细胞凋亡，而严重持续的开放则导致细胞坏死。

(3)CYP-D作为MPTP的关键性调控因子，其表达水平与MPTP开放数量呈显著正相关，Cyp-D水平升高，MPTP的开放程度也相应增加，肾组织损伤加重，通过抑制Cyp-D的表达，可发挥保护肾脏的作用，这在很多动物实验中均可发现。

(4)通过敲除、沉默Ppif基因或使用免疫 CsA能抑制CYP-D表达或活性，从而减少MPTP开放，减轻组织损伤，认为Cyp-D是引起细胞损伤的关键性蛋白。

(5)典型的大鼠IRI模型中术后一周肾功能恢复正常，肾小管上皮细胞完全恢复则需要4周或更长时间，此时与肾损伤相关的细胞因子也回到基线水平，

刘长涛等[11]认为缺血损伤后面神经元内Cyp-D水平逐渐升高，7d达到最高，后逐渐降低，21d基本达到正常组织水平，这与我们的实验结果存在出入，术后28dCyp-D仍有表达，且较24h有不同程度增加，可以推测其可能参与了细胞凋亡过程，这有待进一步实验研究。

Caspase家族是存在于细胞质中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，参与调节和执行细胞凋亡最重要的蛋白酶，其中Caspase-3是主要的凋亡效应蛋白，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，被称为“死亡执行蛋白酶”，Caspase-3一旦活化，凋亡必然发生[9]。

本实验中，无论再灌注早期及远期均可发现，随缺血时间延长，Caspase-3蛋白及mRNA的表达均有不同程度升高，且其表达与Cyp-D表达同步。当缺血或缺氧时，CYP-D过度表达促进MPTP开放，线粒体肿胀破裂，释放膜间隙的促凋亡蛋白如细胞色素C、AIF等，激活下游的caspase家族，从而产生一系列凋亡级联反应的发生，此即经典的经线粒体凋亡途径，结合既往的实验研究[10,22]，本实验将Caspase-3的表达作为细胞凋亡的标志，由此推测Cyp-D介导的线粒体功能障碍除早期引起细胞损伤外，并促进远期细胞凋亡的发生。有研究表明细胞凋亡可引起远期肾小管间质纤维化，且与Casepase过度表达较大关系[23,24]。

传统理念一直把30min作为常温下肾脏缺血损伤的极限时间，认为一旦超过此极限时间，将导致肾脏功能及病理形态学发生不可逆性损伤[25,26]，但部分动物实验和临床研究却认为肾脏安全的热缺血时间可以超过30min，甚至选择性肾动脉阻断60或90min肾功能无明显升高[27-29]，所以对IRI作用机制的研究并探讨安全的热缺血时间仍是泌尿外科及器官移植邻域的研究热点。线粒体作为细胞的能量工厂，缺血、缺氧导致能量代谢障碍并由此引发的细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要原因，而CyP-D是构成 MPTP关键性的调控因子，是反应线粒体结构及功能障碍的指标。根据病理检查、Cyp-D及Caspase-3蛋白及mRNA的表达研究结果得出小于30 min为肾脏热缺血的安全时间，这与胡红林等[30]在小鼠肾缺血再灌注损伤中发现30 min后血清肌酐、尿素和肾病理组织学评分均升高，35-45 min肾缺血时间热缺血是制备肾缺血再灌注损伤模型较为理想的时间的结果是一致的。同样Porpiglia等[31]、 Funahashi等[32]、徐辉照[33]研究腹腔镜部分肾切除术术后患者肾功能变化，发现热缺血时间超过30min近期及远期均能造成肾功能损害，术后一年仅部分功能恢复。

综上所述，通过研究Cyp-D介导的线粒体功能障碍在大鼠肾缺血再灌注损伤中作用的发现，Cyp-D作为损伤蛋白能早期较好的反应缺血再灌注损伤的程度，明确肾热缺血再灌注时间，为临床阻断肾脏血流及器官移植提供可靠的实验依据，同时其过度表达诱导MPTP不可逆开放，可作为缺血再灌注损伤的作用靶点，对防止肾缺血再灌注损伤具有重要的临床意义。