颈项透明层增厚胎儿的超声及产前诊断结果分析

杜秀凤，史淑琼，陈淑芬，钟进，宋春林，朱晓丹

(广东省佛山市妇幼保健院产前诊断中心，广东 佛山 528000)

0 引言

颈部透明层厚度(nuchal translucency，NT)，是指孕 11 ～ 13+6周胎儿颈后皮肤的厚度，由颈后部皮下组织内液体积聚形成的无回声带，一般情况下NT会随孕周的增加而上升，孕14周后胎儿淋巴系统发育完全，胎儿颈项部积聚的液体迅速引流而不再进展。孕早期胎儿颈项透明层增厚是指大于头臀径相对应的NT值正常范围的第95百分位数。NT 增厚与染色体异常的发生呈正相关，还与微缺失/微重复综合征、胎儿心脏或骨骼畸形、重型地中海贫血、努南综合征等的发病有关[1-3]。本研究通过分析 NT 增厚胎儿的超声及介入性产前诊断结果，在传统的染色体核型分析基础上同时检测高通量测序染色体拷贝数变异(CNV-seq)，对 NT 增厚胎儿的遗传学特点进行分析，为无创产前检测技术(NIPT)及CNV-seq在孕妇胎儿染色体非整倍体筛查中的应用提供数据支持，总结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

2017年1月至2020年7月在佛山市妇幼保健院进行早孕期胎儿超声检查，结果显示NT增厚的361例单胎妊娠胎儿为研究对象。其胎儿超声检查结果显示，胎儿头臀径长(CRL)为45～84mm，NT值为2.5～12.9mm，孕妇年龄19～45岁。纳入标准：①单胎；②胎儿超声检查孕周满足11～13+6周；③胎儿NT值＞第95百分位或≥3.0mm，45mm≤CRL≤84mm；④其他：排除了自身恶性肿瘤、染色体异常、干细胞移植手术等。

1.2 方法

1.2.1 超声检查

在孕11～13+6周进行，选择腹部超声检查，胎儿自然姿势取正中矢状面，尽可能将图像放大，使图像只显示胎儿头部及上胸，胎儿颈部皮肤与软组织间半透明组织间的最大厚度值重复测量3次，取最大数值。

1.2.2 高通量基因测序的无创产前检测技术

抽取孕妇外周血10mL，于48h内进行血浆分离并纯化，提取样本的血浆DNA。将带有序列标签的接头引物用于构建血浆DNA文库。利用illumina NextSeq CN500平台进行大规模并行基因组测序。应用生物信息工具放大并分析外周血中不同染色体水平的差异，将每个样本测序的序列与人类参考基因组进行比对，最终得出胎儿患染色体非整倍性风险。

1.2.3 染色体核型分析

对NIPT高风险及NT异常的孕妇进行遗传咨询，知情同意后进行绒毛膜穿刺(11～13+6)或羊水穿刺(17～24周)，取得的标本进行细胞培养、收获、制片并经G显带染色，在光学显微镜下分析染色体核型。

1.2.4 染色体拷贝数变异检测(CNV-seq)从羊水中提取微量(50～100ng)

基因组DNA，通过超声法将大片段DNA打碎，通过末端标记、接头连接和PCR扩增进行DNA文库的构建。使用美国illumina公司NextSeq CN500测序仪器平台，对样品DNA 进行大规模平行测序，测序结果通过生物信息分析，与公共数据库(OMIM、DGV、DECIPHER、UCSC和Pubmed)进行比对，将染色体拷贝数变异分为五类：致病、可能致病、良性、可能良性和临床意义不明(VOUS)。

2 结果

2.1 一般情况

胎儿NT值为2.5～14.8mm，单纯性NT增厚胎儿262例(72.6%)，伴其他超声异常胎儿99例(27.4%)，其中单纯NT增厚胎儿有35例无创NIPT高风险。所有孕妇平均年龄31.72岁(19～45岁)，其中高龄103例(28.5%)。所有病例均行介入性产前诊断，12例绒毛取样、349例羊膜腔穿刺术，361例均同时行染色体核型分析及CNV-seq检测，共检出异常核型71例(19.7%)，正常核型290例(80.3%)。

2.2 NT增厚胎儿无创基因检测(NIPT)结果分析

35例NIPT高风险中，31例21三体高风险，4例18三体高风险，后经绒毛活检及羊膜腔穿刺分析胎儿染色体核型与NIPT结果一致。

2.3 NT增厚胎儿染色体核型结果分析

71例异常核型中非整倍体67例(94.4%)、结构异常3例(4.2%)、嵌合体1例(1.4%)；21三体综合征共44例、18三体综合征共13例、13三体综合征共1例、性染色体三体9例包 括1例47,XXX、1例47,XYY、2例47,XXY、5例45,X；染色体结构异常3例：分别是46,XN,del(8)(q24.1)；46,XN,der(2)t(2；4)(q37.3：p15.2)pat；47,XN,+i(12)(p10)；嵌 合 体1例：47,XN,+3[33]/47,XN,+18[67]，表1。

表1 361例NT 增厚胎儿染色体核型结果分析

2.4 NT增厚胎儿CNV-seq结果分析

361例 胎 儿 中，112 例(31.0%)检 出 CNVs，其 中 致 病性 CNVs79例(21.9%)，VOUS 21例(5.8%)，良 性 CNVs 12例(3.3%)。致病性CNVs79例，其中71例与前文染色体核型异常结果一致，CNV-seq在 290例核型正常胎儿中额外检出8例(2.8%)致病性 CNVs 及 21例(7.2%)VOUS，表2。

表2 正常染色体核型胎儿中8例致病性 CNVs结果

3 讨论

3.1 英国学者在90年代初在超声检查中发现早孕期胎儿颈部皮下均存在无回声带特征，并使用颈部透明层来描述这一现象，后更多学者发现早孕期颈后皮下积水有不同表现，有无分隔及多分隔水囊瘤，在孕14周后可逐渐消退或形成颈部皮肤皱褶。NT增厚的病因与颈淋巴囊汇入淋巴系统失败有关，淋巴液受阻后积聚在颈部，颈后皮肤就会增厚。淋巴回流障碍仅是NT增厚的病理原因之一，透明基质增加和胶原纤维网发育紊乱使唐氏综合征胎儿颈部发生海绵样改变而液体积聚，心力衰竭时静脉回流障碍、骨骼发育不良使胸腔缩窄、胎儿非免疫性水肿等都可以导致NT增厚。NT增厚的众多原因中，胎儿染色体异常是最重要的，特别是21三体综合征，此外三倍体、18三体综合征、13三体综合征及性染色体非整倍体等胎儿也会出现增厚[4]。黄冬冰[5]对382例NT≥3 mm孕妇进行研究结果显示NT 增厚胎儿染色体核型异常检出率为 22.4%，以 21- 三体为主(54.1%)；黄婷婷[6]对208 例 NT≥2.5 mm孕妇行介入性产前诊断，致病性染色体异常检出率为 23.56%，主要为 21-三体综合征；王宏[7]研究549例NT≥3.0mm孕妇的产前诊断结果认为 T21、T18、T13、Turner综合征的 NT均值分别为4.0mm、5.1mm、6.3mm、6.5mm，染色体异常的概率与NT增厚成正比。本研究发现NT增厚胎儿的致病性染色体异常以非整倍体为主，发生率94.4%(67/71)，NT增厚的判断临界值是2.5mm还是3.0mm，目前国内学者还没有共识，尚需进一步研究。

3.2 无创产前检测技术(Noninvasive prenatal genetic testing，NIPT)

提取孕妇外周血中胎儿游离 DNA，检测胎儿是否患 21三体、18三体、13 三体综合征，与传统的血清学筛查相比较有着更高的准确率及更低的假阳性率，且已在临床应用中取得显著成效，避免了一部分不必要的有创性穿刺风险如流产、感染、羊水渗漏等。Liang[8]等的研究发现基因组的表达与GC含量呈线形关系，通过大规模平行测序技术NIPT对24种染色体非整倍体的检测都是可行的，针对T21、T18、T13、T9和性染色体非整倍体的灵敏度为100%，特异度为99.71%。史淑琼[9]等研究认为NIPT在临床工作中可以提高筛查能力，减少不必要的有创性产前诊断操作。翟敬芳[10]研究认为NT异常联合NIPT对胎儿非整倍体阳性预测率为20.51%，单胎妊娠高龄孕妇胎儿染色体非整倍体异常可采用两者联合筛查方式。我们产前诊断中心的研究经验一般以孕早期NT超声为首要检查项目，NIPT可做为补充检查项目，两者联合可大大提高临床对染色体疾病的检出能力及减少漏诊。

3.3 CNV-seq对标本基因组进行测序

测序结果通过生物信息学分析，与人类参考基因组进行比对，可发现受检标本全部的23对染色体非整倍体及染色体变异大于100KB的微缺失/微重复。Liang[11]对72例样本进行回顾性临床研究，认为CNV-seq和微阵列比较基因组杂交技术对于目前已知致病拷贝数变异都能达到相同的检测率，但CNV-seq在某些致病性未知的CNVs检测上更能发现新的染色体疾病，具有良好的特异性及可重复性。Zhu[12]联合运用CNV-seq与SNPArray技术对115例产前超声结构异常的羊水标本进行检测，认为CNV-seq可以替代SNPArray用于产前超声结构异常的胎儿染色体检测中。Liu[13]等比较了传统核型分析与CNV-seq在检测与自发流产相关的染色体异常方面的效能，研究结果表明，CNV-Seq与核型分析相比具有检测时间短、可检测嵌合体以及检测所需样本量低等优势。本研究共发现致病性CNVs79例，其中71例与传统染色体核型异常结果一致，CNV-seq在290例核型正常胎儿中额外检出8例(2.8%)致病性CNVs及21例(7.2%)VOUS。

NT不仅可以确定孕龄，也是筛查早孕期胎儿染色体异常的有效指标，对于NT增厚胎儿建议有资质的医生进行遗传咨询，可选择染色体核型分析及高通量测序技术的染色体拷贝数变异检测(CNV-seq)，并充分告知各种检测的覆盖范围及局限性，并需要在孕中期进行系统结构及胎儿心脏超声筛查，这对降低先天缺陷儿的出生，优生优育及提高人口素质有重要意义。